郭蕓蕓 張雪寒 劉茂軍

摘要：旨在研究豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，簡(jiǎn)稱Mhp）纖毛黏附因子P97以及F7鞭毛蛋白（flagellin，簡(jiǎn)稱F）-霍亂毒素B亞基（cholera toxin B subunit，簡(jiǎn)稱CTB）2種重組蛋白對(duì)口蹄疫（foot-and-mouth disease，簡(jiǎn)稱FMD）滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用。通過(guò)體外表達(dá)獲得pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R1 2種重組蛋白，用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱ELISA）方法檢測(cè)pCold-F7-CTB蛋白的生物學(xué)活性，將重組蛋白分別與口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，簡(jiǎn)稱FMDV）滅活抗原、口蹄疫滅活疫苗混合制備，皮下或腹腔接種Balb/c小鼠，共免疫2次，間隔3周。分別于免疫前、免疫后21、35、49 d采血，49 d后無(wú)菌摘取脾臟。采用阻斷ELISA的方法檢測(cè)小鼠血清口蹄疫O型病毒免疫球蛋白（IgG）抗體滴度，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞亞型比例，以評(píng)估免疫效力。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱SDS-PAGE）和蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）分析結(jié)果表明，2種重組蛋白成功表達(dá)。用GMl（神經(jīng)節(jié)苷脂）-ELISA方法驗(yàn)證pCold-F7-CTB的生物學(xué)活性，發(fā)現(xiàn)融合蛋白F7-CTB保留了與GMl的結(jié)合能力。小鼠免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)皮下注射接種后，單獨(dú)口蹄疫病毒滅活抗原組沒(méi)有產(chǎn)生明顯的抗體水平，而F7-CTB免疫增強(qiáng)劑組比單獨(dú)口蹄疫病毒滅活抗原組的IgG滴度更高。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)重組蛋白與口蹄疫滅活疫苗聯(lián)合使用時(shí)，血清中的IgG滴度明顯增高，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比值上升;P97和F7-CTB混合使用對(duì)口蹄疫滅活疫苗的免疫增強(qiáng)效果最佳。可以初步得出，免疫增強(qiáng)劑P97和F7-CTB具有協(xié)同作用，皮下注射可顯著提高FMD的特異性IgG水平，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比值升高，顯示其具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：口蹄疫;P97;F7-CTB;免疫增強(qiáng)劑

中圖分類號(hào)： S855.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0204-06

口蹄疫（foot and mouth disease，簡(jiǎn)稱FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，簡(jiǎn)稱FMDV）引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的傳染病之一[1]。疫苗接種是預(yù)防和控制口蹄疫最可靠和有效的手段[2]。目前滅活口蹄疫疫苗的使用仍最為廣泛[3-4]?，F(xiàn)有的口蹄疫疫苗存在免疫后抗體產(chǎn)生慢、抗體水平低和持續(xù)期短的缺點(diǎn)[5]，因此，本研究以增強(qiáng)免疫效力為目的，嘗試研制一種新型免疫增強(qiáng)劑。

結(jié)合豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，簡(jiǎn)稱Mhp）的免疫學(xué)特點(diǎn)，R1區(qū)作為Mhp纖毛黏附因子p97黏附纖毛的主要決定區(qū)，主要引起黏膜免疫和細(xì)胞免疫[6]。同時(shí)也是少數(shù)被證明具備免疫保護(hù)能力的抗原之一[7-8]。鞭毛蛋白作為 TLR-5受體激動(dòng)劑，能誘導(dǎo)強(qiáng)烈、廣泛的免疫反應(yīng)[9]。

鞭毛蛋白（flagellin，簡(jiǎn)稱F）佐劑的效果在流感病毒[10-11]、結(jié)核分枝桿菌[12]和鼠疫菌[13]的研究中已經(jīng)被多次確認(rèn)，鞭毛蛋白是較好的載體及佐劑。Albert等在研制亞單位疫苗時(shí)，將結(jié)腸彎曲菌的鞭毛蛋白的FlaA片段與麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose-binding protein，簡(jiǎn)稱MBP）進(jìn)行融合表達(dá)，得到了MBP-F1aA重組蛋白，通過(guò)口服途徑免疫，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腸道的細(xì)菌完全定植，MBP-F1aA免疫組有71.4%的小鼠有細(xì)菌定植，顯示該重組蛋白在一定程度上抵御了結(jié)腸彎曲菌的感染[14]。Delaney等用flagellin-L1R（FR）重組蛋白（將牛痘病毒L1R抗原序列連到細(xì)菌鞭毛蛋白N端）免疫小鼠，結(jié)果能產(chǎn)生與天然L1R相互作用的抗體，F(xiàn)R重組蛋白更能促進(jìn)抗原特異免疫球蛋白（IgG）的產(chǎn)生，加強(qiáng)免疫后可產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫應(yīng)答，對(duì)小鼠能提供100%的保護(hù)[15]。大腸桿菌霍亂毒素（CT）具有黏膜免疫佐劑活性，是細(xì)菌類毒素，研究發(fā)現(xiàn)，CT的B亞單位單獨(dú)作用，表現(xiàn)為無(wú)毒性，但仍可保持較強(qiáng)的佐劑活性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的黏膜系統(tǒng)免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)Th1、Th2型細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞因子的表達(dá)[16]。Hou等將霍亂毒素B亞基（cholera toxin B subunit，簡(jiǎn)稱CTB）作為黏膜佐劑，與HIV-1DNA（人免疫缺陷病毒-1的DNA）疫苗聯(lián)合后免疫小鼠，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生高水平的Thl和Th2型細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，同時(shí)提高血清中Env蛋白的IgG抗體水平[17]。Miyata等將CTB與蛋白MSP1-19耦合，可以提高血清和支氣管肺泡灌洗液中的IgG抗體水平[18]。由以上結(jié)果可以看出，CTB無(wú)論是作為黏膜免疫佐劑還是抗原遞送載體，都有良好的免疫增強(qiáng)作用。本研究將F7和CTB基因進(jìn)行連接后重組表達(dá)，并與P97重組蛋白聯(lián)合或分別單獨(dú)作用，從體液免疫及細(xì)胞免疫角度來(lái)評(píng)估其免疫應(yīng)答，以期改善傳統(tǒng)疫苗的缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

PCold Ⅰ-F7、pUC57-CTB質(zhì)粒均由由農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;pET32a-P97-R1由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所豬病研究室惠贈(zèng);大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5α和BL21（DE3），購(gòu)自TransGen公司。

1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、Sal Ⅰ、Xba Ⅰ和T4 DNA連接酶，購(gòu)自TaKaRa公司;蛋白純化試劑盒，購(gòu)自GE公司;辣根過(guò)氧化物酶（HRP）-小鼠抗組氨酸（histidine，簡(jiǎn)稱His）標(biāo)簽、HRP-羊抗鼠-IgG和HRP-羊抗兔-IgG，購(gòu)自博士德生物工程有限公司;CTB蛋白、兔源抗大腸桿菌不耐熱性腸毒素（Heat-labile enterotoxin B subunit，簡(jiǎn)稱LTB）抗體、神經(jīng)節(jié)苷脂1（Ganglioside，簡(jiǎn)稱GM1）和胎牛血清，購(gòu)自Sigma公司;PE-CyTM7 Hamster Anti-Mouse CD3e、PE Rat Anti -Mouse CD4和FITC Rat Anti-Mouse CD8a，購(gòu)自美國(guó)BD公司;單組分3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（3，3′，5，5′-Tetra-methylbenzidine，簡(jiǎn)稱TMB）顯色液Ⅰ、無(wú)血清培養(yǎng)基RPM 1640、Triton x-114，購(gòu)自南京助研生物技術(shù)有限公司;MONTANIDE ISA 206 VG，購(gòu)自賽彼科（上海）特殊化學(xué)品有限公司;內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自Thermo公司;口蹄疫O型液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱ELISA）抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

6周齡Balb/c小鼠，購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院。

1.4 pCold I-F7-CTB重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的克隆質(zhì)粒pUC57-CTB用限制性內(nèi)切酶Sal Ⅰ、Xba Ⅰ酶切，獲得目的基因CTB，將其插入到表達(dá)載體pCold I-F7相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold I-F7-CTB。

1.5 重組菌的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pCold-F7-CTB、pET32a-P97-R1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），涂布于LB平板（含100 μg/mL氨芐青霉素）上。過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，酶切鑒定，獲得重組菌株pCold I-F7-CTB/BL21（DE3）和pET32a-P97-R1/BL21（DE3）。

1.6 重組蛋白的表達(dá)

1.6.1 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá) 將上述重組菌于37 ℃繼續(xù)快速培養(yǎng)至D600 nm=0.4～0.6，加異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，簡(jiǎn)稱IPTG）至終濃度為1 mmol/L（同時(shí)設(shè)空載體對(duì)照組）;將pCold I-F7-CTB/BL21菌株于 16 ℃、18～24 h誘導(dǎo)表達(dá)，并將pET32a-P97-R1/BL21菌株于37 ℃、5 h誘導(dǎo)表達(dá)，收集細(xì)菌。

1.6.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱SDS-PAGE）鑒定重組蛋白質(zhì)的表達(dá) 各取3 mL上述誘導(dǎo)培養(yǎng)物，于12 000 r/min離心1 min，收集菌體，用1/10體積的 0.01 mol/L 磷酸緩沖鹽溶液（簡(jiǎn)稱PBS，pH值為7.4）重懸菌體，在冰水浴中超聲裂解至菌體全部破碎，取部分超聲裂解菌體作為全菌蛋白質(zhì)，將剩余部分離心分離菌體上清液和沉淀。通過(guò)SDS-PAGE分別檢測(cè)全菌、上清液和沉淀，分析重組蛋白的表達(dá)形式。

1.7 重組蛋白的純化和蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）分析

對(duì)于2種誘導(dǎo)重組菌pCold I-F7-CTB/BL21（DE3）和pET32a-P97-R1/BL21（DE3），參照GE公司的His TrapTM HP說(shuō)明書(shū)，對(duì)上清液進(jìn)行純化。用SDS-PAGE分析純化效果，同時(shí)用純化后的蛋白進(jìn)行Western Blot分析，通過(guò)RC DC Protein Assay檢測(cè)純化蛋白的濃度，并用Triton X-114法去內(nèi)毒素，用顯色法檢測(cè)內(nèi)毒素含量，具體操作參照使用說(shuō)明書(shū)。

1.8 GM1-酶聯(lián)免疫吸附

用100 μL pH值為9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（含2 μg神經(jīng)節(jié)苷脂GM1）包被96孔酶聯(lián)板，于4 ℃過(guò)夜;用 200 μL/孔 的2%牛血清白蛋白（BSA）于37 ℃封閉2 h;每孔加入12.5 ng pCold-F7-CTB蛋白，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照，于37 ℃孵育2 h;加入以1 ∶ 1 000體積比稀釋的兔源抗LTB，于37 ℃孵育2 h;加入以1 ∶ 1 000體積比稀釋的HRP-羊抗 兔-IgG，于37 ℃孵育1 h;用3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色;加入終止液，測(cè)定D450 nm。

1.9 小鼠免疫接種

1.9.1 免疫試驗(yàn)1 將6周齡的Balb/c小鼠隨機(jī)分成4組，5只/組，皮下注射配制的液體試劑，每只注射0.1 mL。配制方法：按照5 μg/只的蛋白量與口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，簡(jiǎn)稱FMDV）滅活抗原混合制備，具體分組和免疫劑量見(jiàn)表1。共免疫2次，間隔3周。分別于免疫前與免疫后21、35、49 d在小鼠眼眶靜脈叢采血，測(cè)定抗體水平。

1.9.2 免疫試驗(yàn)2 將6周齡的Balb/c小鼠隨機(jī)分成8組，5只/組，按照5 μg/只的蛋白量與FMDV滅活抗原混合后，再按1 ∶ 1的比例添加MONTANIDE ISA 206 VG制備口蹄疫滅活疫苗。比較P97、F7-CTB 2種重組蛋白單獨(dú)添加以及混合添加對(duì)口蹄疫滅活疫苗的免疫增強(qiáng)作用，同時(shí)比較皮下、腹腔2種免疫途徑的差異。具體分組和免疫劑量見(jiàn)表2。共免疫2次，間隔3周。分別于免疫前、免疫后21、35、49 d在小鼠眼眶靜脈叢采血，測(cè)定抗體水平。

1.10 血清中口蹄疫O型病毒抗體IgG的檢測(cè)

用口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，分別于免疫前與免疫后21、35、49 d采集血液，分離血清，檢測(cè)方法參照具體說(shuō)明書(shū)。

1.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+和CD8+亞型比例于首免 49 d 時(shí)，取 1×106/mL 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞加入1.5 mL 無(wú)菌離心管中，用1 mL 0.01 mol/L PBS，于1 500 r/min離心5 min，棄去上清，用溶有PE-CyTM7 Hamster Anti-Mouse CD3e、PE Rat Anti-Mouse CD4和FITC Rat Anti-Mouse CD8a熒光抗體的300 μL熒光洗液[100 mL，0.01 mol/L PBS，pH值為7.4，用2% N-溴代琥珀酰亞胺（NBS）]重懸細(xì)胞，充分混勻后于4 ℃避光孵育30 min，用 0.01 mol/L PBS洗滌2次，每次1 mL，于1 500 r/min離心 5 min，棄上清，將管底細(xì)胞用500 μL熒光保存液（100 mL，0.01 mol/L PBS，pH值為7.4，2%葡萄糖，0.1% NaN3）重懸，利用流式細(xì)胞儀（BD AccuriTM C6 Plus）檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞中CD3+、CD4+和CD8+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。