劉春雪 李葉芳 關(guān)文靈

摘要：以野生大丁草、鉤苞大丁草花粉為材料，采用離體培養(yǎng)法，研究大丁草屬2種植物花粉萌發(fā)的最適條件以及適合花粉保存的貯藏方法。結(jié)果表明，大丁草和鉤苞大丁草花粉萌發(fā)最適宜的培養(yǎng)基相同，均為部分ME3+600 g/L PEG200，最高萌發(fā)率分別為47.11%和44.40%。2種植物花粉萌發(fā)最適合的溫度差別較大，最適合大丁草花粉萌發(fā)的溫度為30 ℃，萌發(fā)率為51.09%;而最適合鉤苞大丁草花粉萌發(fā)的溫度為25 ℃，萌發(fā)率為51.90%。2種植物花粉自然條件下的離體壽命均較短，僅可維持48 h。4 ℃低溫干燥貯藏有利于延長2種植物花粉的壽命，貯藏15 d后萌發(fā)率均高于10%，而室溫貯藏、-20 ℃冷凍貯藏15 d后萌發(fā)率均低于10%。

關(guān)鍵詞：大丁草屬;花粉萌發(fā)力;適宜條件;離體壽命;貯藏方式

中圖分類號： Q945.34? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0173-04

收稿日期：2018-02-03

基金項目：云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)花卉苗木產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（編號：2017KJTX0010）。

作者簡介：劉春雪（1992—），女，河北秦皇島人，碩士研究生，主要從事園林植物資源利用與創(chuàng)新研究。E-mail：306143396@qq.com。

通信作者：關(guān)文靈，博士，教授，主要從事園林植物種質(zhì)資源及植物造景研究。E-mail：158066692@qq.com。? 大丁草屬（Gerbera）植物是菊科（Compositae）帚菊木族中的一屬，全世界有近80種，主要分布于非洲，次為亞洲東部及東南部。我國有20種，除個別種遍及于南北各地外，絕大部分集中于西南地區(qū)，云南有16種，占全國種類的80%[1]。

該屬最常見的植物非洲菊（Gerbera jamesonii）觀賞價值和經(jīng)濟價值較高，是一種應用廣泛的切花材料[2]。本屬其他植物在國內(nèi)多作民間用藥[3]，如大丁草（Gerbera anandria）可用于清熱利濕、解毒消腫、止咳、止血[4];鉤苞大丁草（Gerbera delavayi）可清熱利濕、消積殺蟲，也可作為我國西南少數(shù)民族人民編織火草服飾的原料[5-6]。

大丁草和鉤苞大丁草為大丁草屬的2個野生種。經(jīng)過野外調(diào)查以及田間觀察，2個種對白粉病抗性較強。將大丁草、鉤苞大丁草與非洲菊進行種間遠緣雜交，有望培育出抗病性較強的非洲菊新品種。因此需要充分了解大丁草、鉤苞大丁草花粉生活力和貯藏特性。目前，對大丁草、鉤苞大丁草的研究主要集中于化學成分及藥理活性[3-4，7]、環(huán)境脅迫對種子萌發(fā)的影響[8-10]、組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)[11-12]、遺傳多樣性[5-6，13]、基因測序分析[14-15]等，花粉萌發(fā)方面的研究未見報道。本試驗以野生大丁草、鉤苞大丁草為材料，采用液體培養(yǎng)基萌發(fā)法來篩選適合大丁草花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度，并探討不同貯藏條件對大丁草、鉤苞大丁草花粉生活力的影響，旨在為其遠緣雜交提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2015年11月從云南省祿豐縣采集生長健壯的野生大丁草、鉤苞大丁草種苗，并栽于云南農(nóng)業(yè)大學園林苗圃大棚內(nèi)。栽植株行距為16 cm×16 cm，栽后進行常規(guī)田間管理。大丁草于2016年9月開始陸續(xù)開花，鉤苞大丁草于2016年12月開始陸續(xù)開花。于晴天08：00—09：00采集盛花期花粉。

1.2 試驗時間及地點

試驗于2016年9月至2017年1月在云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院實驗室進行。

1.3 試驗方法

采用離體萌發(fā)法[16]，花粉萌發(fā)培養(yǎng)基參考趙宏波等的方法[17]，以部分ME3培養(yǎng)基（MgSO4·7H2O 370 mg/L、KNO3 950 mg/L、CaCl2·2H2O 880 mg/L、H3BO3 50 mg/L）為基礎(chǔ)，將液體培養(yǎng)基滴于凹面載玻片，把花粉散播于培養(yǎng)基，放于裝有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，根據(jù)試驗需要培養(yǎng)?；ǚ垭x體萌發(fā)率統(tǒng)計以花粉管長于花粉直徑為標準，每次每個處理分別取3個固定大小的視野統(tǒng)計，單次統(tǒng)計的花粉數(shù)不少于50個，重復3次[2]。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 不同濃度的PEG200對花粉萌發(fā)的影響 采集新鮮的大丁草、鉤苞大丁草花粉，分別撒播在添加了不同濃度的PEG200的部分ME3培養(yǎng)基上（表1），置于25 ℃的智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后在生物顯微鏡下觀察每種培養(yǎng)基上花粉萌發(fā)的情況。根據(jù)結(jié)果篩選出最適于花粉萌發(fā)的PEG200濃度。

1.4.2 花粉萌發(fā)最適溫度篩選 采集新鮮大丁草、鉤苞大丁草花粉，使用“1.4.1”節(jié)所得的最適培養(yǎng)基，在不同溫度的智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察不同溫度對花粉萌發(fā)的影響，設(shè)置處理溫度為15、20、25、30、35、40 ℃。統(tǒng)計并計算萌發(fā)率，根據(jù)結(jié)果篩選出最適合花粉萌發(fā)的溫度。

1.4.3 貯藏方法對花粉壽命的影響 采集新鮮大丁草、鉤苞大丁草花粉，不經(jīng)過任何處理放于室溫下，分別于0、1、2、4、6、12、24、30、48 h后測定花粉活力，培養(yǎng)24 h后觀察花粉萌發(fā)情況。使用“1.4.1”節(jié)所得的最適培養(yǎng)基，“1.4.2”節(jié)所得的最適溫度。記錄并統(tǒng)計萌發(fā)率（萌發(fā)率=萌發(fā)的花粉數(shù)/總的花粉數(shù)×100%）。

測定出室溫條件下花粉的壽命。同時測定貯藏方法對花粉壽命的影響。采集新鮮大丁草、鉤苞大丁草花粉，首先放置于裝有硅膠干燥劑的干燥器內(nèi)干燥24 h，然后分三部分貯藏：（1）室溫貯藏。將干燥后的花粉用封口膜封口，放入密閉、裝有硅膠干燥劑的自封袋中，將自封袋封口，置于室溫環(huán)境貯藏。（2）4 ℃冷藏貯藏。將干燥后的花粉用封口膜封口，放入密閉、裝有硅膠干燥劑的自封袋中，將自封袋封口，置于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏貯藏。（3）-20 ℃冷凍貯藏。將干燥后的花粉用封口膜密封封口，放入密閉、裝有干硅膠燥劑的自封袋中，將自封袋封口，置于-20 ℃冰箱內(nèi)冷凍貯藏。分別在5、10、15 d 后測定不同貯藏方式下的花粉萌發(fā)力。使用“1.4.1”節(jié)所得的最適培養(yǎng)基，“1.4.2”節(jié)所得最適溫度，記錄并統(tǒng)計萌發(fā)率，并根據(jù)結(jié)果得出花粉最適貯藏溫度。

在父本、母本花期不遇時，需對花粉進行妥善貯藏。在室溫條件下，大丁草屬2種植物的花粉活力均下降最快，15 d后2種植物的花粉萌發(fā)率均低于10%。對地被菊[24]、小菊花[31]等菊科植物花粉的貯藏研究也表明，室溫條件不利于花粉活力的保持和壽命的延長。原因可能是室溫環(huán)境下酶活性強，花粉的呼吸作用等生理代謝活動活躍，使活力下降迅速。有研究表明，低溫可降低花粉呼吸作用及其他生理功能，有利于花粉較長時期保存活力[32]。尾葉紫薇花粉在干燥6～8 h后，在4 ℃條件下貯藏25 d后仍然保持較高的萌發(fā)率和較長的花粉管[33];菠蘿蜜花粉在干燥3 h后，在4 ℃的環(huán)境條件下生命力可延長20 d[34]。本研究顯示，大丁草屬2種植物的花粉在4 ℃低溫干燥貯藏條件下的活力變化趨勢與其他植物一致，可有效延長花粉壽命，在貯藏15 d后2種植物的花粉活力均高于10%。-20 ℃低溫冷凍條件與室溫條件相比，2種植物的花粉活力也維持在較高水平，但與4 ℃儲藏相比沒有顯著優(yōu)勢。因此大丁草屬2種植物花粉最好的貯藏方法是 4 ℃ 低溫干燥冷藏，但貯藏時間不宜超過15 d。

影響花粉壽命的因子還有許多，如花粉含水量、干燥時間、貯藏環(huán)境的相對濕度以及超低溫等[35-36]，它們對大丁草屬2種植物花粉生活力的影響以及更好的貯藏方法還有待于進一步研究。

參考文獻：

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M]. 北京：科學出版社，1996：73.

[2]孫 強，蘆建國，沈永寶，等. 非洲菊花粉和柱頭生物學習性初步研究[J]. 上海交通大學學報（農(nóng)業(yè)科學版），2008，26（1）：78-80，90.

[3]肖 瑛，丁 怡. 大丁草屬植物的化學成分和藥理活性研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，14（6）：51-57.

[4]He F，Wang M，Gao M H，et al. Chemical composition and biological activities of Gerbera anandria[J]. Molecules，2014，19（4）：4046-4057.

[5]徐曉丹. 鉤苞大丁草的纖維特性及遺傳多樣性研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2016.

[6]歐成川. 鉤苞大丁草的葉片形態(tài)多樣性研究及優(yōu)異纖維種質(zhì)發(fā)掘[D]. 昆明：昆明理工大學，2016.

[7]谷黎紅，李 銑，陳英杰，等. 大丁草中抗菌活性成分的研究：人腸道微生物對大丁甙及其類似物的代謝產(chǎn)物[J]. 藥學學報，1988（7）：511-515.

[8]姜云天，李玉梅，顧地周，等. Na2CO3脅迫對野生大丁草種子萌發(fā)的影響[J]. 種子，2014，33（6）：86-88.

[9]姜云天，沈紅梅，顧地周，等. NaCl脅迫對長白山區(qū)野生大丁草種子萌發(fā)的影響[J]. 現(xiàn)代農(nóng)村科技，2014（17）：59-59，60.

[10]姜云天，顧地周，周 繇，等. 鹽脅迫對野生大丁草種子萌發(fā)的影響[J]. 中國園藝文摘，2014（8）：25-27.

[11]凌 杰，寧淑香. 大丁草愈傷組織及試管苗培養(yǎng)的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2012，40（5）：2671-2673.

[12]黃玉玲，朱躍珍，李永平，等. 火草組培快繁技術(shù)研究[J]. 林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2016，41（4）：72-74，79.

[13]歐成川，鄭 偉，王談笑，等. 鉤苞大丁草的葉片形態(tài)多樣性研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學，2016，57（2）：194-197.

[14]陳 菁，鄭 偉，王談笑，等. 鉤苞大丁草高通量轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達分析[J]. 西北植物學報，2017，37（3）：470-477.

[15]王談笑，鄭 偉，陳 菁，等. 基于ITS序列分析鉤苞大丁草九個居群的親緣關(guān)系[J]. 廣西植物，2017，37（3）：329-334.

[16]胡適宜. 植物學實驗方法（一）：花粉生活力的測定[J]. 植物學通報，1993，10（2）：60-62.

[17]趙宏波，陳發(fā)棣，房偉民. 栽培小菊和幾種菊屬植物花粉離體萌發(fā)研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報，2005，28（2）：22-27.

[18]Zhang H Q，Croes A F. A new medium for pollen germination in vitro[J]. Plant Biology，1982，31（1/2）：113-119.

[19]Subbaiah C C. A polyethylene glycol based medium for in vitro germination of cashew pollen[J]. Canadian Journal of Botany，1984，62（12）：2473-2475.

[20]Roberts I N，Stead A D，Ockendon D J，et al. Pollen stigma interactions in Brassica oleracea[J]. Theoretical and Applied Genetics，1980，58（6）：241-246.

[21]宋紅霞，吳旭艷，武 喆，等. PEG對胡蘿卜花粉離體萌發(fā)的影響[J]. 長江蔬菜，2011（6）：22-24.

[22]何 琪，何 芳，劉 鵬，等. PEG-4000、蔗糖及pH值對七子花花粉萌發(fā)的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2006，45（2）：214-216.

[23]Jamesl B，Beyoungh K. The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth[J]. American Journal of Botany，1963，50（9）：859-865.

[24]呂晉慧，趙 耀，任 意，等. 地被菊花粉生活力測定及影響因素研究[J]. 華北農(nóng)學報，2011，26（4）：189-193.

[25]葉利民. PEG和鈣對梔子花粉萌發(fā)的影響[J]. 種子，2012，31（7）：35-36，39.

[26]趙劍穎，張華麗，張西西，等. 萬壽菊花粉活力及柱頭可授性研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2012，28（19）：159-163.

[27]劉林德，張洪軍，祝 寧. 刺五加花粉活力和柱頭可授性的研究[J]. 植物研究，2001，21（3）：375-380.

[28]姬慧娟，尹林克，嚴 成，等. 多枝檉柳的開花動態(tài)及花粉活力和柱頭可授性研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2009，37（5）：114-118.

[29]胡適宜. 被子植物胚胎學[M]. 北京：人民教育出版社，1982：51-58.

[30]孫 強. 非洲菊雜交育種技術(shù)及優(yōu)良品系選育初步研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學，2007.

[31]王 濤，祝朋芳，董玉芝. 小菊花粉生活力及貯藏力的研究[J]. 遼寧林業(yè)科技，2010（1）：8-11.

[32]尹佳蕾，趙惠恩. 花粉生活力影響因素及花粉貯藏概述[J]. 中國農(nóng)學通報，2005，21（4）：110-113，193.

[33]王曉玉，徐 婉，胡 杏，等. 尾葉紫薇開花及花粉萌發(fā)研究[J]. 浙江農(nóng)林大學學報，2012，29（6）：966-970.

[34]余 慶，李映志，汪永保，等. 菠蘿蜜花粉萌發(fā)及貯藏特性研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學，2014，41（8）：60-64.

[35]楊 紅，顧 妍，張朝陽，等. 不同輻射及溫度處理對西瓜花粉生活力的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（2）：111-113.

[36]張 婷，趙 林，張 梅，等. 不同蘋果品種花粉的生物學特性[J].