甄丹妹 郭景紅 韓興

摘要：為研究玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活性代謝產物RM對黃瓜幼苗的誘導抗病性，通過篩選不同濃度RM對黃瓜白粉病的防效，得出最佳誘導抗性濃度;采用試劑盒對RM誘導后接種白粉病菌的黃瓜幼苗進行防御酶活性以及活性氧含量變化情況的檢測。試驗結果表明，RM對黃瓜白粉病的最佳誘抗?jié)舛葹?00 mg/L，施用RM后過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性提高，過氧化氫（H2O2）含量升高。

關鍵詞：玫瑰黃鏈霉菌;誘導抗病性;黃瓜白粉病;過氧化氫酶;過氧化物酶;H2O2

中圖分類號： S436.421.1+2? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）11-0148-03

白粉病是黃瓜種植上危害很普遍、發(fā)病較嚴重的病害，黃瓜白粉病在全國各露地和保護地栽培的黃瓜上均普遍發(fā)生，一般黃瓜生長中后期病情發(fā)展迅速，導致葉片枯黃、植株干枯，條件適宜時，幾天時間內，白粉病即可迅速傳遍整個溫室，造成黃瓜大面積減產[1]。目前生產上對該病害的防控主要是以化學防治為主，但由于病原菌對化學農藥抗藥性的產生以及白粉病病情擴展迅速等特點，給其防治帶來了很大困難，亟需更加環(huán)保、穩(wěn)定、持久的防治方法和策略。近年來，利用誘導因子誘導植物自身產生抗病性和進行作物免疫的方法作為防治病害更為安全有效、經濟實用、環(huán)境友好的新措施，越來越受到研究者們的關注和重視[2]。

病原菌侵入植物引起寄主體內一系列生理指標的變化，可能誘導植株產生一些對自己生長有利并且可以在一定程度上抑制病原菌的物質，即誘導植物產生抗病性。苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）等防御酶與植物的抗病反應密切相關，可以作為衡量誘導抗病性的重要指標。余曉燕等研究了粉紅單端孢菌體蛋白激發(fā)子誘導杏果產生對黑斑病的抗性，POD、過氧化氫酶（CAT）、PPO、β-1-3 葡聚糖酶、幾丁質酶活性都有所增強，并檢測到氧爆發(fā)[3];趙建等發(fā)現(xiàn)施用寡雄腐霉發(fā)酵液對番茄葉片細胞膜具有保護性，能降低丙二醛含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）、PPO和PAL活性[4];姚佳采用放線菌發(fā)酵液防治油菜菌核病時，發(fā)現(xiàn)其可以誘導油菜SOD、PPO、POD活性升高[5];薛磊采用生防鏈霉菌ZY153、B49、X4、Z13、S42誘導棉花抗黃萎病時，發(fā)現(xiàn)其可顯著提高棉花葉片、根系的POD、PPO和PAL活性，增加棉花葉片內單寧、二元酚、木質素及游離脯氨酸含量[6];暴增海等采用海洋放線菌BM-2發(fā)酵液誘導黃瓜根部防御酶PAL、POD、PPO、SOD活性升高，提高黃瓜對枯萎病的抗性[7]。另外，活性氧過氧化氫（H2O2）是一種可以擴散的小分子，不僅可以直接殺死病原菌，參與膜脂過氧化，介入植物過敏反應（HR），而且過氧化氫還可以導致細胞壁木質化和HR細胞的死亡，過氧化氫還可以跨過細胞膜進入侵染點以外的組織中，作為第2信使激活防衛(wèi)基因的表達，最終導致植物對病原菌產生抗性[8]。一些真菌產生的特異性誘導物能誘導寄主細胞氧化爆發(fā)，大豆在2種不同的非特異性誘導物Verticillium dahliae 277和Oligogalacturonide作用下，5 min內即出現(xiàn)氧爆發(fā)（ROS）[9]。冷害、臭氧、重金屬、傷害、植物激素和病原物侵染等許多逆境都會產生活性氧，活性氧可以誘導植物激活一些脅迫相關的基因，對抗環(huán)境的變化[10]。此外，在細胞外基質中H2O2及其他活性氧的作用不止局限于參與防衛(wèi)反應，還參與調控細胞壁組分的合成，比如木質素合成[11]。

玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63是分離自馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤的1株生防鏈霉菌[12]，筆者從該生防菌發(fā)酵液中分離到1組具有抑菌活性的次級代謝產物，經過分離、提取和結構鑒定，最終確定該活性組分為2種五烯大環(huán)內酯類抗菌活性代謝產物Roflamycoin和Menmyco-A（簡稱RM），并對其結構和制備過程申請了國家發(fā)明專利（專利申請?zhí)?01710091330.X）。為明確玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活性代謝產物RM誘導植株抗病性的情況及其作用機制，本研究檢測分析了RM誘導黃瓜幼苗對白粉病的抗性與防御酶POD、CAT活性及過氧化氫含量的關系，篩選出RM誘導抗病性的最佳濃度，為進一步揭示玫瑰黃鏈霉菌代謝產物誘導抗病性的生理生化作用機制提供了理論依據(jù)，同時也為開發(fā)新型植物免疫誘抗劑用于瓜類蔬菜白粉病的防控提供了思路和途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 供試黃瓜品種為津春3號，由天津市農業(yè)科學院黃瓜研究所提供。

1.1.2 供試菌 供試黃瓜白粉病菌從田間自然發(fā)病的黃瓜植株上采集，用小刷子將采來的發(fā)病葉片上的白粉孢子刷入無菌水中，用紗布及漏斗將雜質過濾掉制成孢懸液，并向其中加入少量吐溫-20。用血球計數(shù)板計數(shù)，白粉孢子濃度為 2.2×105個/mL。現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 試驗方法

1.2.1 玫瑰黃鏈霉菌發(fā)酵液的制備 將斜面保存的玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)7 d至孢子成熟，將孢子刮下，制成孢子懸浮液，調整孢子濃度為5×108 CFU/mL，向裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中接入200 μL孢子懸浮液，30 ℃、200 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)5 d。

1.2.2 玫瑰黃鏈霉菌活性代謝產物RM的提取 發(fā)酵液經4 500 r/min離心30 min，棄上清，菌絲沉淀用約3倍體積甲醇浸泡，在超聲波清洗器中振蕩處理30 min，濾紙過濾得黃色甲醇溶液，在旋轉蒸發(fā)儀中50 ℃將甲醇減壓蒸發(fā)至干，加入適量乙酸乙酯，超聲振蕩，使其充分混合，可見有黃色粉末狀物質逐漸析出，靜置2 h，抽濾得到黃色粉末狀物質，即為代謝產物RM。

1.2.3 RM誘導抗性最佳濃度的篩選 試驗于2017年4月10日至5月30日在河北農業(yè)大學植物保護學院溫室進行，將黃瓜種子置于28 ℃培養(yǎng)箱中催芽，待露白時播種于直徑為15 cm的營養(yǎng)缽中（基質為V營養(yǎng)土 ∶ V土壤=1 ∶ 1），溫室培養(yǎng)至第1張真葉展開、第2張真葉展開2/3時待用。對溫室黃瓜苗先噴施RM藥劑以及對照藥劑，24 h后噴施白粉病菌的孢懸浮液。共9組處理，每組處理8棵苗，定期觀察并記錄其發(fā)病情況。

1.2.4 溫室誘導抗病性試驗 設置5個處理：處理1，無菌水作空白對照（陰性對照）;處理2，水楊酸處理，濃度為 5 mmol/L（陽性對照）;處理3，篩選出的最適濃度的RM處理;處理4，只接白粉病菌;處理5，RM處理后接白粉病菌。每個處理20盆。

用100 mg/L的RM溶液噴霧處理黃瓜幼苗，設置陰性對照為水，陽性對照為水楊酸（5 mmol/L），24 h后接種白粉病菌[13]，分別于處理后1、3、5、7 d取樣，采用蘇州科銘生物技術有限公司試劑盒進行CAT、POD活性測定和活性氧H2O2含量的測定。

1.2.5 誘抗結果的調查及統(tǒng)計 白粉病病害分級標準：0級：無病斑;1級：病斑面積占整個葉面積5%及以下;3級：病斑面積占整個葉面積6%～10%;5級：病斑面積占整個葉面積11%～20%;7級：病斑面積占整個葉面積21%～40%;9級：病斑面積占整個葉面積40%以上。

病情指數(shù)=100×∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調查總葉數(shù)×最高級代表值）;防治效果=對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)對照區(qū)病情指數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 RM誘導黃瓜抗病性最佳濃度的篩選

調查結果如表2所示，噴施80、100、160 mg/L RM后對白粉病的防效明顯高于60 mg/L武夷菌素對照處理;噴施 100 mg/L RM防效最好，因此在后續(xù)的溫室誘導抗性試驗中，選擇100 mg/L RM進行噴施處理。

2.2 CAT活性的測定

CAT是一種誘導酶，由植物本身所引起的CAT活性的增加與其抗病性呈正相關。由圖1可知，噴施RM處理后3 d CAT活性高于陰性對照（水）處理，低于陽性對照（水楊酸）處理，5 d時RM處理與陰性對照CAT活性接近;噴施RM后接種白粉病原菌處理的CAT活性在處理后5 d與其他處理差異顯著，且達到最大值，表明噴施RM后再噴施白粉病原菌處理的CAT活性高于只噴施白粉病原菌的處理，噴施RM后CAT活性在病原菌侵染的條件下增加得更為明顯。

2.3 POD活性的測定

POD在植物抗逆體系中主要用來消除氧自由基。由圖2可以看出，噴施RM處理后1～3 d與噴施水處理的POD活性接近，5 d達到最高值，為587.65 U/g，噴施水楊酸后POD活性持續(xù)升高，在5 d達到最高，噴施水后POD活性增加不明顯，通過RM處理與陽性對照（水楊酸）、陰性對照（水）比較可知，噴施RM后可以引起POD活性升高，并與陰性對照差異顯著;先噴施RM再接種白粉病原菌后5 d，POD活性達到最高值，為679.26 U/g，只接種白粉病原菌的POD活性也有所升高，但是，先噴施RM后再接白粉病原菌處理的POD活性在處理5 d時高于只接種白粉病原菌處理。

2.4 H2O2含量的測定

過氧化氫屬于活性氧的一種，活性氧主要有超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫。氧爆發(fā)在植株過敏性壞死反應中起著非常重要的作用，病原菌侵染后的很短時間內，活性氧在侵入點急劇增加。由圖3可以看出，噴施RM后接種白粉病原菌，在1～3 d，過氧化氫含量增加，對入侵的白粉病菌起到了抵御的作用，在3～7 d，可能由于體內防御酶活性增高，將過氧化氫分解為水，導致H2O2含量降低，只接種白粉病原菌處理和噴施RM處理的H2O2含量在處理后3、5 d稍高于陰性對照;噴施無菌水和水楊酸處理的H2O2含量變化不明顯。此外噴施RM處理后再接種病原菌的H2O2含量在3 d達到最高值，而只噴施白粉病菌的處理則在處理后5 d達到最高值。

3 討論與結論

通過對黃瓜白粉病的溫室誘抗試驗可以發(fā)現(xiàn)，玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63產生的活性代謝產物RM對防治黃瓜白粉病具有保護作用，其誘導黃瓜產生白粉病抗性的最佳濃度為100 mg/L。黃瓜葉片噴施RM后引起黃瓜植株內過氧化氫含量增高，抵制了白粉病原菌的侵染，酶活性不同程度的增加，并明顯高于對照，通過體內防御酶如POD、CAT清除活性氧自由基，防止活性氧含量過高對植株的損傷。由于活性氧對細胞的毒害作用，植物細胞具有高效的活性氧清除機制。活性氧可以被很多酶清除，如參與抗氧化系統(tǒng)的POD、SOD和CAT，它們對于維持抗氧化系統(tǒng)的平衡具有重要作用。Keppler等使煙草懸浮培養(yǎng)細胞感染野火病細菌后，活性氧大量產生，細菌數(shù)量明顯下降，但加入SOD等活性氧清除劑后，細菌數(shù)量增加，并延緩了HR的發(fā)生[14]。CAT、POD等防御酶是存在于植物體內與抵制病原微生物侵染有關的重要酶，RM誘導后引起H2O2含量升高，CAT、POD活性增強，因此誘導抗病性很可能是玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63防病抗病的主要作用機制之一。除了筆者前期研究中發(fā)現(xiàn)的Men-myco-93-63活性代謝產物具有直接抑菌作用外（數(shù)據(jù)未發(fā)表），該活性產物RM還可以誘導黃瓜植株中主要防御酶活性的提高，并且這種誘導作用在病原菌侵染的條件下表現(xiàn)得更為明顯。研究POD、CAT活性及H2O2含量與玫瑰黃鏈霉菌活性產物誘導黃瓜抗病性的關系，初步證實了RM具有誘導抗病性作用，在此基礎上，今后還將對RM誘抗的信號途徑、分子機制進行更為深入的研究。

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