李宏淼 馬連學 曾瑞霞 單偉

1錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院解剖學教研室 121001; 2遼寧省健康產(chǎn)業(yè)集團撫礦總醫(yī)院(中國醫(yī)科大學第七臨床學院)檢驗科，撫順 113008

Müller細胞為視網(wǎng)膜膠質細胞，在糖尿病狀態(tài)下，過度活化的Müller細胞會導致神經(jīng)損傷，引起血管生成因子增加，產(chǎn)生新生血管，進而導致慢性炎性視網(wǎng)膜環(huán)境，最終導致細胞死亡[1-3]。神經(jīng)調節(jié)蛋白-1(NRG-1)為一類具有神經(jīng)保護作用的細胞間信號轉導蛋白，對神經(jīng)元的生長、存活具有重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，應用NRG-1治療局灶性腦缺血大鼠模型，可發(fā)揮強大的神經(jīng)保護作用，有效減少神經(jīng)元死亡數(shù)目[5]。盡早使用外源性NRG-1，可有效防止視神經(jīng)損傷大鼠模型中神經(jīng)元損傷，對于損傷后神經(jīng)再生、神經(jīng)功能的恢復大有益處[6]。但NRG-1對糖尿病狀態(tài)下Müller細胞損傷的影響尚不清楚。因此，本研究以高濃度葡萄糖培養(yǎng)Müller細胞，探討NRG-1對高葡萄糖對Müller細胞的影響及機制，為尋找糖尿病視網(wǎng)膜損傷的治療方案拓展思路。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 Müller細胞株購自上海鈺博公司。

1.2 主要試劑和儀器 胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone生物科技有限公司；BCA 試劑盒、Annexin V-FITC凋亡試劑盒、噻唑藍法(MTT)試劑盒、JC-1試劑盒、丙二醛含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性試劑盒均購自碧云天公司；Bcl-2、Bax、β-actin抗體購自美國Abcam公司；流式細胞儀購自美國BD公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國SIM公司；熒光倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組 將Müller細胞株置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清)，當細胞覆蓋瓶底達80%左右時傳代。24 h后給予不同處理因素，對各處理因素的劑量均進行濃度梯度預實驗，根據(jù)最適濃度進行分組培養(yǎng)，分為對照組(空白對照)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖)、NRG-1處理組(30 mmol/L葡萄糖+80 mg/L NRG-1)，3組均給與DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清，并于培養(yǎng)的第3 天檢測指標。

1.4 MTT檢測Müller細胞活力 調整Müller細胞懸液為1×104/200 μl，置于96孔板中培養(yǎng)，24 h細胞貼壁后分組處理，在培養(yǎng)第3 天時再換100 μl無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 h后加入5 g/L MTT溶液20 μl，3 h后棄溶液，加DMSO并振蕩，使藍色結晶物完全溶解。利用酶標儀檢測490 nm波長處光吸收值(A值)，按如下公式計算細胞活力：細胞活力=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.5 試劑盒檢測Müller細胞丙二醛含量及SOD活性 用4℃生理鹽水制備5%Müller細胞勻漿，5 000 r/min(r=10 cm)離心30 min，取上清；按試劑盒操作得到OD值，根據(jù)OD值分別計算Müller細胞的丙二醛含量及SOD活性。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將各組細胞處理為單細胞懸液，以2×106個/ml接種6孔板中，培養(yǎng)48 h后常規(guī)消化，5 000 r/min(r=10 cm)離心10 min，棄上清，收集細胞，PBS洗2次，按Annexin V-FITC說明書操作測定細胞凋亡率。

1.7 Western印跡檢測Müller細胞Bcl-2、Bax蛋白表達 提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，蛋白上樣量為40 μg加入15 μl樣品緩沖液。10% SDS-PAGE凝膠電泳，后轉移至PVDF膜，以含1% BSA的TBST室溫封閉2 h；加入一抗4℃孵育過夜；TBST洗滌4次，每次5 min；加入HRP標記的二抗室溫2 h，孵育后TBST洗滌4次，每次5 min；ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析灰度值，實驗共重復6次。

1.8 JC-1法檢測Müller細胞線粒體膜電位 傾去各組Müller細胞培養(yǎng)基，預冷PBS洗滌1次，依次加入1 ml新培養(yǎng)基及1 ml JC-1染色液，混勻于培養(yǎng)箱中37℃裝載探針20 min。裝載探針后，將配置的JC-1染色緩沖液清洗各組Müller細胞2 次。熒光顯微鏡下觀察分析。

2 結果

2.1 各組Müller細胞形態(tài)及細胞生長狀態(tài) 通過顯微鏡簡單觀察可發(fā)現(xiàn)，高糖組細胞生長緩慢，胞體腫脹，細胞邊緣折光性增強。與高糖組相比，NRG-1處理組上述狀態(tài)有所改善(圖1，封2)。

2.2 MTT法檢測Müller細胞活力 與對照組相比，高糖組細胞活力明顯降低；而與高糖組相比，NRG-1處理組細胞活力有所增加(P均<0.01)，見表1。

2.3 各組Müller細胞丙二醛含量及SOD活力 與對照組相比，高糖組丙二醛含量明顯增加，SOD活力明顯降低。而與高糖組相比，NRG-1處理組丙二醛含量明顯減少，SOD活力明顯增加(P均<0.01)，見表1。

表1 3組細胞活力、丙二醛含量、SOD活性比較

2.4 流式細胞儀檢測結果 與對照組相比，高糖組細胞凋亡率明顯增加；而與高糖組相比，NRG-1處理組細胞凋亡率明顯降低(P均<0.01)，見表2，圖2(封2)。

2.5 Western印跡檢測結果 與對照組相比，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡Bax蛋白表達明顯增加，Bcl-2/Bax比值降低；而與高糖組相比，NRG-1處理組Bcl-2表達明顯增加，Bax表達明顯降低，Bcl-2/Bax比值升高(P均<0.01)，見圖3，表2。

2.6 3組Müller細胞線粒體膜電位 JC-1在正常線粒體聚集呈現(xiàn)紅色熒光，而在線粒體損傷、膜電位降低時成單體呈現(xiàn)綠色熒光。與對照組相比，高糖組Müller細胞線粒體膜電位明顯降低；而與高糖組相比，NRG-1處理組線粒體膜電位明顯增加(P均<0.01)，見圖4(封2)，表2。

表2 3組Müller細胞凋亡率、Bcl-2、Bax表達比較

甲狀腺微小癌的熱消融治療

3 討論

研究表明，除微血管病變外，視網(wǎng)膜神經(jīng)組織病變在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)展中也非常關鍵，其主要病理表現(xiàn)有Müller細胞凋亡、谷氨酸堆積的毒性作用等[7-9]。本研究對正常的視網(wǎng)膜Müller細胞株進行高濃度葡萄糖處理進而模擬糖尿病視網(wǎng)膜病變時視網(wǎng)膜Müller細胞的損傷狀態(tài)，結果發(fā)現(xiàn)，高糖狀態(tài)下，Müller細胞生長緩慢，胞體腫脹，隨著培養(yǎng)時間的延長，氧化應激反應增強，最終會引起Müller細胞的凋亡。

Müller細胞為視網(wǎng)膜膠質細胞，可跨越整個視網(wǎng)膜，幾乎與每種細胞類型都有接觸，其獨特的位置使其對保持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)尤為重要[1]。視網(wǎng)膜功能正常時，Müller細胞可調節(jié)神經(jīng)遞質循環(huán)，防止谷氨酸毒性，通過空間緩沖并重新分配離子，參與視網(wǎng)膜循環(huán)，從而調節(jié)視網(wǎng)膜營養(yǎng)供應。任何對視網(wǎng)膜環(huán)境的干擾都會影響Müller細胞的正常功能，從而參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生[10]。氧化應激是細胞組織病變時，活性氧簇生成增多攻擊細胞及組織的現(xiàn)象[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Müller細胞損傷與氧化應激水平增強有關，氧化應激增強最終會引起Müller細胞的凋亡[12-13]。丙二醛是脂質過氧化代謝產(chǎn)物，SOD是自由基清除劑。丙二醛含量上調，SOD活性下降，可間接反映組織氧化應激程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下Müller細胞生長緩慢，胞體腫脹，丙二醛含量升高，SOD活性降低，細胞活力明顯下降，而細胞凋亡率明顯增加，提示高糖環(huán)境下會引起Müller細胞氧化應激增強，從而導致細胞凋亡。對高糖環(huán)境下的Müller細胞給予NRG-1治療后，丙二醛含量降低，SOD活性增加，細胞活力明顯增加，而凋亡率明顯下降。說明NRG-1可降低氧化應激水平，抑制高葡萄糖誘導的Müller細胞凋亡。NRG-1在神經(jīng)病變領域一直備受關注。最新研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1通過細胞外信號調節(jié)激酶5依賴的絲裂原活化蛋白激酶途徑，減緩腦缺血-再灌注損傷的病變[15]。另外，NRG-1還可通過調節(jié)酪氨酸激酶受體2受體通路，緩解脊髓運動神經(jīng)元相關疾病的損傷[16]。也有研究發(fā)現(xiàn)，NRG-1通過調節(jié)小膠質細胞炎性反應，對腦卒中大鼠具有神經(jīng)保護作用[17]。Müller細胞軸突內(nèi)含有豐富的線粒體，糖尿病狀態(tài)下易造成線粒體損傷，從而導致線粒體膜電位降低，凋亡相關蛋白表達異常，最終引起細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境下Bcl-2表達下降，Bax表達增加，Bcl-2/Bax比值降低，線粒體膜電位降低，細胞凋亡率增加，提示高糖環(huán)境下Müller細胞的凋亡可能與線粒體凋亡通路有關。給予NRG-1處理后，Bcl-2表達增加，Bax表達下降，Bcl-2/Bax比值增加，線粒體膜電位也隨之增加，細胞凋亡率明顯下降，說明NRG-1可抑制Müller細胞的凋亡，其機制可能與抑制線粒體凋亡途徑有關。

綜上所述，高糖環(huán)境下可激活氧化應激反應，從而誘導Müller細胞凋亡。NRG-1可抑制高糖誘導的Müller細胞凋亡，其機制可能與抑制線粒體凋亡途徑有關。但因糖尿病發(fā)病機制復雜，NRG-1對糖尿病時Müller細胞損傷的作用還有待進一步探討。