余麗然 陳宜挺

廣東省潮州市慢性病防治站 521000

近年全球結(jié)核疫情回升伴隨耐藥結(jié)核分枝桿菌的不斷增加，引起全球各界人士的高度重視。全球有1/3的人感染過結(jié)核分枝桿菌，亞洲地區(qū)占全球受感染人群的2/3。我國是全球22個結(jié)核病高發(fā)病國家之一，發(fā)病人數(shù)位居世界第二位，僅次于印度[1]。第五輪中國全球基金結(jié)核項目，廣東耐藥監(jiān)測項目開始在廣東省內(nèi)各市監(jiān)測展開。結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病至今仍為重要的傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病，同時其耐藥性正在逐步升高。

1 材料與方法

1.1 菌株 納入來源于廣東省潮州市潮安區(qū)監(jiān)測點，潮州市潮安區(qū)慢性病防治站就診的初、復(fù)治痰涂片陽性患者和調(diào)查期間新登記診斷的初、復(fù)治肺結(jié)核痰涂片陽性患者為對象標準，共計413例。

1.2 羅氏培養(yǎng)基 產(chǎn)家：珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3 痰涂片及抗酸染色 操作方法按《痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》標準要求進行。

1.4 痰結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)及藥敏

1.4.1 分離培養(yǎng)：采用4.00%的氫氧化鈉為前處理液堿處理方法，接種于酸性羅氏培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，成功培養(yǎng)之后的菌株用專用標本運輸箱送至市中心實驗室做藥敏培養(yǎng)。

1.4.2 藥敏培養(yǎng)法：采用世界衛(wèi)生組織耐藥監(jiān)測小組制定的比例法。在斜面培養(yǎng)基上進行9種抗結(jié)核藥物，分別是異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(SM)、卡那霉素(KM)、氧氟沙星(OFX)、卷曲霉素(CPM)、丙硫異煙肼(PTO)、對氨基水楊酸(PAS)的藥敏試驗，用標準接種環(huán)分別蘸取1環(huán)(即0.01ml)10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌懸液，用劃線法均勻接種至對照培養(yǎng)管培養(yǎng)基表面和藥敏培養(yǎng)基表面；應(yīng)注意使菌液盡可能均勻分散于培養(yǎng)基斜面，最終接種菌量為10-4mg和10-6mg。接種后的培養(yǎng)基置于(36±1)℃培養(yǎng)，5%～10%的CO2可以促進分枝桿菌的生長，垂直放置，至4周后報告結(jié)果。

1.4.3 結(jié)核菌培養(yǎng)結(jié)果判斷：以加入對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基是否生長為判斷依據(jù)，有菌生長為非結(jié)核桿菌，無菌生長為結(jié)核桿菌。

1.4.4 藥敏結(jié)果報告：如果耐藥百分比>1.00%者報告耐藥(R)，否則報告敏感(S)。提示：若高稀釋度菌懸液(10-4mg/ml)在對照管培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)少于20個菌落，則應(yīng)該從對照培養(yǎng)管傳代培養(yǎng)，重復(fù)實驗。

其中單耐藥：結(jié)核菌對異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素四種藥中任何一種耐藥；多耐藥：結(jié)核菌對2、3種抗結(jié)核藥物耐藥，但不包括同時耐異煙肼及利福平的菌株[2]；耐多藥結(jié)核(MDR)：是指結(jié)核桿菌至少對異煙肼、利福平2種或以上抗結(jié)核藥產(chǎn)生耐藥的結(jié)核菌。廣泛耐多藥結(jié)核病(XDR)：指結(jié)核病人不但對異煙肼、利福平耐藥，同時還對氟喹諾酮類以及氨基糖甙類耐藥。

1.5 質(zhì)量控制 藥敏試驗由國家結(jié)核病控制中心參比實驗室對省實驗室進行藥敏控制。痰涂片和染色按《痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》，每批實驗室用H37RV作為質(zhì)控菌株。

2 實驗結(jié)果

菌種鑒定采用PNB(對硝基苯甲酸)法，臨床分離的413株痰培養(yǎng)陽性菌株中，共檢出16株非結(jié)核分枝桿菌，占所有菌株3.87%，結(jié)核分枝桿菌397株，占96.13%；其中耐多藥結(jié)核菌共14株，耐多藥率達3.39%。結(jié)核分枝桿菌藥敏結(jié)果見表1，2014—2016一線抗結(jié)核藥耐藥情況見圖1。

表1 2014—2017年413株結(jié)核分枝桿菌藥敏結(jié)果統(tǒng)計表

圖1一線抗結(jié)核藥耐藥情況

3 討論

近年來，全球耐藥結(jié)核的發(fā)病率呈上升趨勢，已嚴重威脅人類的身體健康。耐藥監(jiān)測和藥敏試驗對于了解一個地區(qū)的耐藥情況和臨床醫(yī)生制定合理的治療方法起到重要指導(dǎo)作用[3-4]。本研究顯示413株結(jié)核分枝桿菌總耐藥率29.54%(n=122),低于全國結(jié)核病耐藥調(diào)查報告中的35.16%,其中總耐多藥率為3.39%。本實驗研究數(shù)據(jù)表明潮州地區(qū)結(jié)核桿菌耐藥情況較全國結(jié)核耐藥率平均水平低，但是由于臨床上抗結(jié)核藥物的不規(guī)范使用，缺少治療監(jiān)測以致結(jié)核患者錯過最佳治療時間，加上醫(yī)患之間缺少必要的醫(yī)囑導(dǎo)致患者自主停藥等情況，致使體內(nèi)潛伏感染的結(jié)核桿菌對抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥甚至發(fā)展為嚴重的耐多藥。從實驗數(shù)據(jù)可以看出，一線抗結(jié)核藥物異煙肼和利福平的耐藥率分別達到19.61%、8.96%，而二線抗結(jié)核藥方面，耐氧氟沙星的比例高達11.14%，明顯高于其他二線藥物。實驗中也有發(fā)現(xiàn)廣泛耐藥肺結(jié)核患者，這些患者缺乏有效的治療手段，治愈率更低。調(diào)查過程中使用傳統(tǒng)的藥敏方法檢測時間過長，導(dǎo)致部分病人沒有納入或者在等待藥敏結(jié)果期間死亡或失訪。這要求我們必須加強對新發(fā)病人的治療管理、杜絕某些綜合醫(yī)院及其他肺結(jié)核病防治機構(gòu)對結(jié)核病人的不合理治療，大力推行DOST(醫(yī)務(wù)人員直接監(jiān)視下短程化療)方法管理病人[5]。同時積極開展耐藥監(jiān)測，建立有效快速的藥敏試驗，盡早發(fā)現(xiàn)耐多藥(MDR)結(jié)核患者并給予有效的管理和治療，才能阻斷耐藥菌的播散并防止其向廣泛耐多藥結(jié)核菌發(fā)展[5]。二線藥物的種類也有限，希望研制新藥，推出更為便民的快速診斷技術(shù)，在臨床治療中，提供相應(yīng)的用藥指南，同時臨床醫(yī)生在對患者進行藥物治療期間應(yīng)加強其治療監(jiān)測，嚴格執(zhí)行結(jié)核病患者規(guī)范有效的治療，防止耐藥菌株的產(chǎn)生和傳播。堅守結(jié)核治療原則，加強結(jié)核病宣傳教育工作做到早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、規(guī)范治療是控制結(jié)核病發(fā)生的關(guān)鍵所在。