陳 輝

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬遺傳育種重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

豬肉是國(guó)人主要的食用肉類，而隨著人民生活水平的提高，對(duì)優(yōu)質(zhì)豬肉的需求也隨之增加。由于前期人們對(duì)瘦肉型豬的高強(qiáng)度選擇，使得豬肉的風(fēng)味和多汁性等品質(zhì)下降[1]，而脂肪沉積是影響豬肉品質(zhì)（風(fēng)味和多汁性等）的主要因素。MicroRNA（miRNA）最早是在1993年由Lee等在秀麗隱桿線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的，研究發(fā)現(xiàn)了一種可以與Line4基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）形成互補(bǔ)序列從而抑制該基因的翻譯，這是MicroRNA首次被發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志[2]。miRNA是長(zhǎng)度約為 22 nt（18～24nt）的內(nèi)源性小分子RNA，在動(dòng)植物機(jī)體通過(guò)靶向目的基因致使基因表達(dá)受阻，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)植物機(jī)體的各項(xiàng)生命活動(dòng)（脂肪細(xì)胞增殖分化等過(guò)程）進(jìn)行調(diào)控[3]。有關(guān)miRNA的相關(guān)研究主要集中在人上，筆者通 過(guò) MicroRNAs（miRNA） 數(shù) 據(jù)庫(kù)（http://www.mirbase.org/） 檢 索了人（Human）相關(guān)miRNA，截止到目前，已有2 815條miRNA數(shù)據(jù)；筆者同樣檢索了豬（swine）相關(guān)miRNA，結(jié)果僅為219條相關(guān)miRNA數(shù)據(jù)，而與豬脂肪沉積相關(guān)的miRNA數(shù)據(jù)就更少了，因而需要進(jìn)一步深入挖掘和鑒定豬脂肪沉積相關(guān)的miRNA。研究表明，miR-27[4]、miR-34[5]、miR-125[6]以及miR-130[7]等miRNA家族可通過(guò)靶向目的基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)豬脂肪沉積進(jìn)行調(diào)控，故就4個(gè)miRNA在豬脂肪沉積中的調(diào)控進(jìn)行綜述，同時(shí)分析了miRNA的形成及作用機(jī)制，旨在為進(jìn)一步深入挖掘和鑒定與豬脂肪沉積相關(guān)miRNA提供理論依據(jù)和思路，進(jìn)而為豬肉品質(zhì)的遺傳改良提供策略和方向。

1 miRNA的形成及其作用機(jī)制

1.1 miRNA的形成過(guò)程

豬miRNA是在細(xì)胞核經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ（RNA Pol II）的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[8]。具體形成過(guò)程分為3步。第一步是miRNA基因通過(guò)RNA Pol II的轉(zhuǎn)錄形成初級(jí)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄物（pri-miRNA）；第二步是通過(guò)RNase核酸內(nèi)切酶III（DROSHA）將pri-miRNA加工形成前體miRNA（pre-miRNA），產(chǎn)生的pre-miRNA（具有二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)）通過(guò)核蛋白（Exportin-5，一種GTP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)；最后一步即是通過(guò)Dicer酶（一種RNA聚合酶III）和TRBP（RNA結(jié)合蛋白）和PACT進(jìn)行切割形成雙鏈miRNA，至此成熟的miRNA加工形成。其具體形成過(guò)程見(jiàn)圖1[9]。

1.2 miRNA的作用機(jī)制

圖1 miRNA的形成過(guò)程

miRNA主要是形成沉默復(fù)合物（RISC）后，用于種子序列靶向目的基因從而抑制基因的表達(dá)。在細(xì)胞核加工形成雙鏈miRNA，此時(shí)的miRNA可以形成活性RNA誘導(dǎo)形成沉默復(fù)合物（RISC），RISC中包含的Argonaute 2蛋白（Ago2）是RISC的關(guān)鍵催化酶，一旦Ago2與RISC結(jié)合，目的基因的3'UTR將會(huì)被miRNA的5'末端的互補(bǔ)序列（稱為種子序列，由于種子序列多為6～8 nt，因而一種miRNA可靶向多種基因，同理基因也可被多種miRNA靶向）識(shí)別并結(jié)合，從而阻止其翻譯過(guò)程，使靶基因mRNA沉默[8]。

2 豬脂肪沉積相關(guān)miRNA

2.1 miR-27家族

miR-27家族包括miR-27a、miR-27b以及miR-27c，研究發(fā)現(xiàn)miR-27家族通過(guò)靶向脂蛋白酶（LPL）基因，對(duì)LPL的表達(dá)進(jìn)行抑制，從而降低了脂肪沉積相關(guān)基因的表達(dá)，最終抑制了脂肪的沉積，對(duì)豬肉品質(zhì)的改善具有消極作用[10]。研究表明，miR-27在脂肪組織的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），豬皮下脂肪中miR-27的表達(dá)與脂肪沉積標(biāo)志基因過(guò)氧化物酶增殖物激活受體（PPARγ）-γ以及脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這表明miR-27對(duì)脂肪沉積具有抑制作用[11]。關(guān)于miR-27a的研究，有研究發(fā)現(xiàn)miR-27a在藏豬背最長(zhǎng)肌的表達(dá)量極顯著高于在大白豬中的表達(dá)量（P＜0.01），相關(guān)性分析表明，miR-27a的表達(dá)量與IMF含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[12]。相似的研究報(bào)道，miR-27a在豬背部皮下脂肪的表達(dá)水平與背膘厚以及單不飽和脂肪酸呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而與胴體瘦肉率呈顯著正相關(guān)，表明miR-27a對(duì)豬脂肪沉積具有抑制作用，而有助于改善豬胴體性能[13]。但也有關(guān)于miR-27a正調(diào)控脂肪沉積的研究，Li等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在沂蒙黑豬中，背膘較厚的個(gè)體中miR-27a具有更高的表達(dá)量；楊雪梅等[14]采用熒光定量PCR技術(shù)（Q-PCR）探討了miR-27a的表達(dá)量與我國(guó)地方豬種肉質(zhì)性狀（風(fēng)味物質(zhì)）的關(guān)系，結(jié)果表明miR-27a的表達(dá)量與地方豬種肌內(nèi)脂肪（IMF）含量呈正相關(guān)關(guān)系，這表明miR-27a對(duì)肉質(zhì)性狀具有正調(diào)控作用，造成差異的原因可能是品種原因。在miR-27b的研究方面，研究發(fā)現(xiàn)miR-27a和miR-27b在皮下脂肪細(xì)胞的表達(dá)量顯著高于肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的表達(dá)量（P＜0.05），進(jìn)一步分析表明，miR-27b能夠靶向PPARγ基因，從而抑制其表達(dá)，降低脂肪的沉積[15]。綜上表明，miR-27家族通過(guò)靶向脂肪沉積相關(guān)基因從而對(duì)脂肪沉積具有抑制作用，對(duì)豬肉品質(zhì)具有負(fù)調(diào)控作用。

2.2 miR-34家族

miR-34家族主要包括miR-34a、miR-34b以及miR-34c，在豬上研究較多的為miR-34a和miR-34c，故本文主要論述miR-34a和miR-34c在豬脂肪沉積中作用。有關(guān)miR-34a的研究較多，研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a過(guò)表達(dá)增加了肝臟中甘油三脂的含量，轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析表明，miR-34a通過(guò)靶向豬脂聯(lián)素受體2基因（AdipoR2）的3'UTR抑制和AMPK信號(hào)途徑來(lái)抑制PPARα信號(hào)傳導(dǎo)途徑而增加脂肪的含量[5]。李秀秀[16]采用猝滅螢火蟲(chóng)熒光素酶方法確定了miR-34a的種子序列與長(zhǎng)鏈酯酰輔酶A合成酶4(ACSL4)基因的靶向關(guān)系，細(xì)胞增殖分化分析表明，miR-34a靶向ACSL4基因從而抑制其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的增殖分化，從而使脂肪細(xì)胞脂滴含量增加。但也有miR-34a負(fù)調(diào)控脂肪沉積的研究報(bào)道，Sun等[17]研究了miR-34a與人血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α（PDGFRα，PDGFRα通過(guò)激活Erk信號(hào)通路促進(jìn)脂肪形成分化）的靶向關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-34a可以通過(guò)靶向PDGFRα，抑制其表達(dá)，從而抑制脂肪的生產(chǎn)。在miR-34c與脂肪沉積中的研究中，陳粉粉[18]研究miR-34c對(duì)豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞增殖分化的影響，研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-34c后，發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因PPARγ、FABP4和FASN基因的轉(zhuǎn)錄水平（mRNA）被極顯著下調(diào)，蛋白印跡得到了類似的結(jié)果；流式分析表明，過(guò)表達(dá)miR-34c抑制了肌內(nèi)脂肪細(xì)胞的增殖；最終抑制了豬脂肪的沉積，表明miR-34c對(duì)脂肪沉積具有負(fù)調(diào)控作用。

2.3 miR-125家族

miR-125a是miR-125家族的主要成員，也是一種豬脂肪沉積的抑制因子，通過(guò)抑制脂肪細(xì)胞的增殖分化而抑制脂肪的沉積。Du等[6]miR-125a可以直接靶向kruppel 3因子（KLF13），從而抑制豬肌內(nèi)前脂肪細(xì)胞的分化，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)miR-125a的表達(dá)量與IMF含量呈負(fù)相關(guān)；過(guò)表達(dá)miR-125a降低了總飽和脂肪酸（SFA）含量和單不飽和脂肪酸（MUFA）/ SFA比率。在對(duì)鼠的研究表明，miR-125a可能促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖而通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)STAT3抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化[19]。Ji等[20]研究表明，過(guò)表達(dá)miR-125a后會(huì)顯著降低成脂標(biāo)志基因PPARγ，LPL和aP2的mRNA表達(dá)水平；油紅O染色分析表明，過(guò)表達(dá)后miR-125a顯著降低了脂質(zhì)的積累；通過(guò)靶向分析，miR-125a可靶向ERRα基因從而抑制豬脂肪細(xì)胞的分化?？梢种萍?xì)胞的增殖分化而實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪沉積的負(fù)調(diào)控，Song等[21]發(fā)現(xiàn)，miR-125a可靶向轉(zhuǎn)錄因子E2F3的3'UTR，從而負(fù)調(diào)控E2F3的表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-125a后發(fā)現(xiàn)C2C12成肌細(xì)胞的增殖被抑制，最終降低了脂肪的沉積。相似的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-125a后會(huì)導(dǎo)致脂滴降低，成脂標(biāo)志基因PPARγ和aP2的表達(dá)量以及翻譯水平均下調(diào)，同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-125a顯著抑制了豬前體脂肪細(xì)胞的分化；而抑制miR-125a則得到了相反的結(jié)果（促進(jìn)了脂肪前體細(xì)胞的分化）[22]。表明，miR-125a通過(guò)靶向成脂標(biāo)志基因而抑制脂肪細(xì)胞的增殖分化，從而對(duì)豬脂肪的沉積起負(fù)調(diào)控作用。

2.4 miR-130家族

miR-130家族也是一種脂肪沉積的抑制因子，該家族主要包括miR-130a和miR-130b兩大類。在miR-130a與豬脂肪沉積的研究方面，wei等[7]研究了肌內(nèi)脂肪（IM）和皮下脂肪（SC）之間PPARγ的表達(dá)水平差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IM中的PPARγ的mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯著低于SC，而IM中的miR-130a的表達(dá)水平為SC的2.30倍，因此作者進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶活性方法探討miR-130a和PPARγ的表達(dá)關(guān)系，結(jié)果表明miR-130a直接靶向PPARγ，抑制其表達(dá)，進(jìn)而造成IM中的脂肪沉積水平低于SC。miR-130a還可通過(guò)靶向成脂標(biāo)志基因而抑制脂肪細(xì)胞分化，據(jù)李虹儀等[23]報(bào)道，將miR-130a類似物（miR-130a mimics）轉(zhuǎn)染至豬皮下脂肪前體細(xì)胞后連續(xù)誘導(dǎo)8 d，與陰性（亂序序列）對(duì)照相比，miR-130a mimics組細(xì)胞脂滴減少，甘油三酯（TAG）含量顯著降低，脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因LPL和PPARγ的表達(dá)量均顯著下調(diào)（P＜0.05）；而加入miR-130a類抑制物后，細(xì)胞脂滴和TAG含量增加，這表明miR-130a可靶向多個(gè)基因以實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控。miR-130b也可通過(guò)靶向PPARγ等基因來(lái)抑制脂肪的沉積，Pan等[24]發(fā)現(xiàn)miR-130b可以直接靶向PPARγ基因，降低其mRNA水平，從而抑制豬脂肪的沉積。也有研究通過(guò)雙熒光素酶活性方法測(cè)定了miR-130b的表達(dá)與PPARγ、C / EBP-β3 等成脂基因的 3，UTR，抑制目的基因的表達(dá)，研究結(jié)論認(rèn)為miR-130b對(duì)母豬及其仔豬的脂肪沉積起負(fù)調(diào)控作用[25]。綜上表明，miR-130家族通過(guò)靶向成脂相關(guān)基因，進(jìn)而抑制脂肪細(xì)胞的增殖分化，最終對(duì)豬脂肪沉積進(jìn)行負(fù)調(diào)控。

2.5 其他脂肪沉積相關(guān)miRNA

除了上述與豬脂肪沉積相關(guān)的miRNA外，還有miR-17-5p、miR-103、miR-199-5p、miR-425p以 及miR-7134-3p等miRNA參與了豬脂肪沉積的負(fù)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-17-5p會(huì)顯著抑制豬前脂肪細(xì)胞 NCOA3、PPARγ以及FABP4基因的表達(dá)（P＜0.05），同時(shí)顯著降低TAG的含量（P＜0.05）；而抑制miR-17-5p表達(dá)則結(jié)果相反，研究認(rèn)為miR-17-5p通過(guò)靶向NCOA3基因來(lái)抑制豬脂肪的沉積[26]。Shi等[27]發(fā)現(xiàn)miR-199-5p是通過(guò)靶向caveolin-1（Cav-1）來(lái)調(diào)控豬脂肪細(xì)胞的分化；Chen等[28]發(fā)現(xiàn)miR-425p可以靶向KLF13，下調(diào)PPARγ基因的表達(dá)進(jìn)而抑制豬肌內(nèi)脂肪的形成；Wang等[29]發(fā)現(xiàn)MARK4基因是miR-7134-3p的靶基因，通過(guò)抑制基因的表達(dá)進(jìn)而抑制閹豬的脂肪沉積。上述miRNA均是脂肪沉積的負(fù)調(diào)控因子，而研究表明miR-103具有促進(jìn)豬脂肪沉積的作用，Li等[30]研究表，過(guò)表達(dá)miR-103后會(huì)促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化，增加誘導(dǎo)8 d后的脂滴積累，同時(shí)促進(jìn)成脂標(biāo)志基因PPARγ基因、aP2基因的表達(dá)量，研究認(rèn)為PPARγ基因有助于豬原代脂肪細(xì)胞中的脂肪沉積，從而對(duì)豬脂肪沉積起正調(diào)控作用。

3 小結(jié)與展望

通過(guò)全文可知，miRNA通過(guò)種子序列靶向目的基因的3，UTR，進(jìn)而從轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行抑制，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。miR-27、miR-34、miR-125以及miR-130家族參與了豬的脂肪沉積 調(diào) 控，miR-27、miR-125、miR-130家族為脂肪沉積的負(fù)調(diào)控因子，miR-34a以及miR-103則是豬脂肪沉積的促進(jìn)因子，這豐富了miRNA在豬脂肪沉積中的研究，為豬肉品質(zhì)的遺傳改良提供了新的策略和思路。盡管miRNA在脂肪調(diào)控中具有重要調(diào)控作用，但有關(guān)miRNA在豬脂肪調(diào)控方面的研究卻鮮有報(bào)道；同時(shí)大部分miRNA相關(guān)研究只是復(fù)制人或小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并未進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究，部分文章雖然論述了miRNA通過(guò)靶向脂肪沉積相關(guān)基因，但卻缺乏科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；總之，與miRNA在人和鼠上的研究相比，miRNA調(diào)控豬脂肪沉積方面的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠[31]。但相信隨著分子生物技術(shù)、豬遺傳改良技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家將會(huì)對(duì)miRNA調(diào)控豬脂肪沉積方面的研究進(jìn)行更加深入系統(tǒng)的研究，同時(shí)鑒定出更多的與脂肪沉積相關(guān)miRNA，從而豐富miRNA的相關(guān)研究，也為豬肉品質(zhì)的遺傳改良提供新的策略和思路。