王宏宇，李志堅，劉思當

（1.山東農(nóng)業(yè)大學，山東 泰安 271000；2.楊凌金海生物技術有限公司，陜西 楊凌 712100）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種急性、烈性傳染病，主要感染偶蹄動物，如牛、羊、豬等[1,2]。患病動物主要表現(xiàn)為發(fā)熱、跛行，其口腔、蹄、乳房等部位皮膚或黏膜出現(xiàn)水泡、潰瘍等病癥，幼畜表現(xiàn)為壞死性心肌炎和出血性腸炎而急性死亡。FMD是世界動物衛(wèi)生組織所列的必須上報的傳染病，被我國列為一類傳染病[3]。FMD自1915年在意大利首次出現(xiàn)后，迅速傳播至世界各地，給全球養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4]。口蹄疫的致死性不高，但病毒長期在動物體內存活，患畜尤其是康復動物長期帶毒、排毒，成為主要的傳染源，并且口蹄疫各血清型之間幾乎沒有交叉保護力[5,6]，感染一種血清型的動物仍有感染另外血清型的危險，故高效多價疫苗免疫成為目前防控口蹄疫的主要手段。

目前常用的口蹄疫抗體檢測方法主要有正向間接血凝試驗、競爭ELISA試驗和液相阻斷ELISA試驗。本試驗中所用的為競爭ELISA方法和液相阻斷ELISA方法。競爭ELISA抗體檢測方法，被檢抗體和酶標抗體競爭性的與包被好的固相抗原結合，因此結合于固相的酶標抗體量與被檢抗體量成反比關系。樣品中的抗體優(yōu)先結合固相抗體，加入酶標抗體后去占據(jù)未結合的抗原位點，通過酶來催化酶標抗體復合物顯色，通過檢測樣品的吸光度（OD值）來計算被檢抗體的含量或者阻斷率，OD值越小，抗體含量和阻斷率越高。液相阻斷ELISA抗體檢測方法是將已知含量的病毒抗原與梯度稀釋后的被檢血清在液相中反應，然后將其轉移到包被有特異性口蹄疫抗體的板中，沒有完全被血清中抗體阻斷的病毒抗原被板中抗體捕獲，再通過酶結合物與底物顯色，通過檢測吸光度（OD值）來判斷抗體滴度。有研究表明，液相阻斷方法4 ℃過夜處理液相比37 ℃，90 min得到的結果更為準確[7]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

3種試驗用疫苗為M1、M2、M3，均為O-A二價豬口蹄疫疫苗，分別購自目前國內口蹄疫疫苗利用率較高的3家公司。2種檢測試劑盒為C1{豬A型口蹄疫抗體（A型）、豬O型口蹄疫抗體（O型）}、C2{A型、O型、口蹄疫非結構蛋白抗體（NS）}，由國外知名公司生產(chǎn)。試驗用45頭仔豬由山東某豬場提供，并提供單獨的圈舍及飼料等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

采集同一批次、生長狀態(tài)良好的50日齡左右的仔豬的血液，檢測其豬口蹄疫O型、A型和NS抗體水平，選擇3種抗體均為陰性或抗體水平低的仔豬45頭，隨機分為3組，每組15頭，飼養(yǎng)于同一豬舍不同的欄圈內。分別于60日齡、90日齡及120日齡對每一圈的豬注射1種豬口蹄疫疫苗，并于每次疫苗注射后28 d從每圈隨機采集10頭豬的血清，分別檢測O型、A型、NS抗體水平，為使結果更加可信，我們采用兩家公司的試劑盒（C1、C2）進行3次重復抗體檢測，按照相應的說明書計算公式進行統(tǒng)計分析，并使用SPSS軟件對檢測結果進行差異性分析。

1.2.2 結果判定

C1試劑盒（A型、O型）判定標準：S/N值≤0.6為陽性，S/N值＞0.6為陰性。C2試劑盒（A型、O型、NS）判定標準：阻斷率（PI）＜50%為陰性，PI≥50%為陽性。

2 結果與分析

2.1 3種疫苗免疫后抗體水平結果

2.1.1 C1試劑盒檢測結果

分離的30份血清用C1試劑盒分別檢測A型、O型抗體，結果A型抗體（見圖1A）在2免后3組均有所下降，但各組在3次免疫后抗體的升降趨勢基本相同，且三者之間的差距不大。豬O型口蹄疫抗體（見圖1B）隨免疫次數(shù)的增加，抗體水平逐漸升高，符合疫苗注射后體內抗體的消長規(guī)律，但疫苗M1和M3之間免疫后抗體水平存在差異，且在1免、2免、3免后抗體水平差異性均為顯著。結果如圖1所示。

2.1.2 C2試劑盒檢測結果

分離的30份血清用C2試劑盒分別檢測A型、O型、NS抗體，發(fā)現(xiàn)M1疫苗組口蹄疫A型的抗體水平較M2差異顯著（圖2A），O型抗體（圖2B）的阻斷率在1免后M1與M2、M3之間存在顯著差異，推測該原因與M1疫苗的抗體降解有關，M1疫苗的抗體維持時間較其他2種疫苗稍短。3種疫苗免疫機體所產(chǎn)生的非結構蛋白抗體（圖2C）幾乎均為陰性，僅M2疫苗組NS抗體數(shù)值稍高，抗體浮動較大。結果如圖2所示。

2.2 3種疫苗免疫后抗體陽性率結果比較

圖1 3種豬口蹄疫疫苗免疫后A型、O型抗體結果比較

如圖3，分離M1、M2、M3口蹄疫疫苗免疫豬群的血清，通過兩家公司的試劑盒檢測A型、O型口蹄疫疫苗的抗體平均陽性率。結果顯示：1免后M1疫苗（圖3A）A型、O型抗體陽性率均較低，但2免、3免后抗體陽性率基本都達到100%。M2疫苗（圖3B）所產(chǎn)生的A型、O型抗體陽性率均較高，即使是1免后，也只有A型抗體陽性率稍低，但也達到了90%。M3疫苗（圖3C）在1免后產(chǎn)生的A型抗體的平均陽性率在75%左右，在2次免疫后即達到100%陽性，豬O型口蹄疫抗體一直處于較高的陽性率水平，1免后就達到近100%陽性。

3 討論

通過對45頭豬分別進行3種豬口蹄疫疫苗的3次免疫接種后抗體的檢測，發(fā)現(xiàn)M1疫苗的抗體水平雖在1免后較其他2種有所欠缺，且陽性率在1免后較低，但在2免、尤其是3免后抗體水平、陽性率上升明顯。M2疫苗的免疫效果較好，且隨免疫次數(shù)的增加，抗體較其他兩種疫苗增長幅度稍大，但免疫M2疫苗后，NS抗體數(shù)值較高，甚至個別出現(xiàn)NS抗體陽性結果。M3疫苗的抗體水平在1免、2免、3免均較好，雖較M2的抗體水平稍低，但M3疫苗免疫組的NS抗體數(shù)值較M2疫苗的低，NS抗體的陽性率均為陰性。由以上結果顯示，M1疫苗的初免抗體水平較低，2免、3免后抗體水平較高，推測M1疫苗的抗原含量較其他2種疫苗稍低且抗體持續(xù)時間較其他2種疫苗短。M2疫苗的免疫效果在3次免疫后均較好，但其NS抗體數(shù)值較其他2種的高，多次疫苗免疫的高胎次繁殖母豬可能存在陽性風險[8]；M3疫苗在3次免疫后的抗體水平均較高，并且其NS抗體含量一直處于陰性狀態(tài)且數(shù)值最低。NS抗體的產(chǎn)生是野毒感染或疫苗在生產(chǎn)的過程中非結構蛋白去除不徹底造成[9,10]，并與免疫劑量和免疫頻率有關 ，一般3次以內的疫苗免疫基本保持陰性[11]。一般豬口蹄疫疫苗首次免疫產(chǎn)生的抗體持續(xù)時間較短，在1個月后加強免疫是十分必要的[8]。

圖2 3種豬口蹄疫疫苗免疫后A型、O型及NS抗體結果比較

注：A、B、C分別為M1、M2、M3 3次免疫后的抗體陽性率

通過試驗分析，我們認為此3種疫苗中M3疫苗的綜合質量評價較好，免疫后抗體持續(xù)時間較長且NS抗體水平較低，即疫苗的抗原含量較高且非結構蛋白含量低。目前市場上豬口蹄疫疫苗種類較多，如何根據(jù)本場實際情況選擇合適的豬口蹄疫疫苗是豬場口蹄疫免疫工作中必須考慮的問題。文章旨在通過幾種疫苗的免疫效果對比分析，為疫苗選擇、免疫程序制定及效果評價提供一定的參考，以提高豬口蹄疫的免疫防控水平。