丁榮榮，姜啟興,*，王 斌，夏文水，楊 方，許艷順

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122 ；2.江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122 ）

酒精性肝損傷是由于長期飲酒造成的。肝細胞脂質(zhì)過氧化導致脂肪肝，接著出現(xiàn)炎癥，最終導致肝硬化甚至肝癌[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2014年關于酒精與健康的全球狀況統(tǒng)計，全球有330萬 人死于有害使用酒精，占所有死亡人數(shù)的5.9%。酒精消費會導致較低齡化死亡和殘疾。該研究發(fā)現(xiàn)，過度飲酒是200多種疾病和傷害的誘因。人體內(nèi)有3 種主要的代謝途徑：肝臟、皮膚和呼吸系統(tǒng)；超過90%的酒精被肝臟的酶系統(tǒng)代謝[2]，所以肝臟是酒精損害的主要器官。

殼寡糖是指通過降解殼聚糖獲得的聚合度在2～20之間的寡糖。與殼聚糖相比，殼寡糖具有良好的水溶性，易于在體內(nèi)被吸收、轉(zhuǎn)化和利用，可以發(fā)揮更重要的生物功能[3]。目前已有研究表明殼寡糖具有很好的抗氧化活性[4]、抑菌活性[5-6]、抗炎止血活性[7]、輔助降血脂作用[8-9]、輔助治療糖尿病的作用[10-11]。2014年，殼寡糖已被批準用于食品的新食品原料。近年來關于殼寡糖作用保護酒精性肝損傷已有部分研究，劉紅云等[12]通過建立急性酒精中毒模型說明殼寡糖對于酒精性肝損傷有保護作用；劉亮亮等[3]解釋了殼寡糖對長期慢性酒精性肝損傷模型的保護作用；Cho等[13]研究了殼寡糖乳酸鹽對乙醛脫氫酶活性的影響，突出強調(diào)了乙醛脫氫酶的作用。本研究以殼寡糖為原料，在前人的研究基礎上，參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003版）建立急性酒精性肝損傷模型，除了從血清指標來闡明殼寡糖的保護作用外，更加強調(diào)對一些肝臟指標的影響，進一步探討殼寡糖對肝臟的保護作用，為開發(fā)安全有效的護肝產(chǎn)品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性昆明小鼠（6～8 周）購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011，動物質(zhì)量證書編號：11400700264351，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2016-0045。

殼寡糖（平均分子質(zhì)量1 299 Da、脫乙酰度85%）為實驗室制備。

聯(lián)苯雙酯滴丸（批號：170505） 北京協(xié)和藥廠；乙醇（體積分數(shù)95%，藥用級） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

LAB DANCEP S25磁力攪拌器 德國IKA公司；DK-8AXX電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；4K15冷凍大容量離心機 德國Sigma公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 日本島津公司；M5酶標儀 美國Molecular Devices公司；ECLIPSE生物顯微鏡 日本尼康公司；超低溫冷凍冰箱 日本三洋電機公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養(yǎng)及分組

動物實驗室溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%。明暗期為12 h/12 h，小鼠自由攝取食物和飲水。適應性喂養(yǎng)1 周后，將60 只雄性昆明小鼠隨機分成對照組（C）、酒精模型組（M）、陽性對照組（B）、低劑量殼寡糖組（CL）、中劑量殼寡糖組（CM）、高劑量殼寡糖組（CH），每組10 只。陽性對照組每天以0.2 mL/20 g mb給藥灌胃150 mg/kg聯(lián)苯雙酯；根據(jù)國家規(guī)定殼寡糖食用量不超過0.5 g/d，3 個劑量殼寡糖組每天分別灌胃70、140、210 mg/kg殼寡糖，對照組和酒精模型組小鼠給予等體積的蒸餾水。

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003版），連續(xù)給藥30 d后，酒精模型組、陽性對照組和3 個劑量殼寡糖組給予12 mL/kg mb的體積分數(shù)50%乙醇溶液，對照組給予蒸餾水并禁食16 h。注射60 mg/kg mb的戊巴比妥鈉溶液后采血分離血清，處死動物。取肝臟稱質(zhì)量后用液氮速凍于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 小鼠體質(zhì)量、進食量及肝臟系數(shù)的測定

小鼠剛進入動物房時稱體質(zhì)量為初始體質(zhì)量/g，最后處死前稱體質(zhì)量為最終體質(zhì)量/g。進食量和肝臟系數(shù)分別根據(jù)公式（1）、（2）計算。

1.3.3 生化指標測定

根據(jù)試劑盒說明書測定血清中ALT、AST活力和TC濃度，以及質(zhì)量分數(shù)10%肝臟勻漿中SOD活力和GSH、MDA含量。

1.3.4 組織病理學觀察

各組小鼠肝臟組織于體積分數(shù)10%福爾馬林固定24 h后，通過石蠟切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色來進行組織病理學觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 殼寡糖對小鼠體質(zhì)量、進食量以及肝臟系數(shù)的影響

表1 殼寡糖對小鼠體質(zhì)量、進食量以及肝臟系數(shù)的影響Table 1 Effect of COS on body mass, food intake and liver coefficient of mice

從表1可見，初始體質(zhì)量、最終體質(zhì)量以及進食量在各個組別之間均沒有顯著性差異。說明灌胃殼寡糖未對小鼠的生長造成影響。模型組肝臟系數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），表明在攝入酒精后肝臟因受損而腫大；與模型組相比，陽性對照組和殼寡糖各劑量組肝臟系數(shù)均顯著降低（P＜0.05），說明殼寡糖和陽性對照可以緩解小鼠肝臟受損情況，陽性對照組的效果比殼寡糖好。

2.2 殼寡糖對酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST活力和TC濃度的影響

ALT、AST活力是反映肝細胞損傷的重要指標，肝細胞發(fā)生嚴重壞死時其活力會明顯升高[14]。從圖1中可知，與正常組相比，模型組ALT、AST活力均極顯著增加（P＜0.01），表明酒精性肝損傷模型成功建立。與模型組相比，陽性對照組和殼寡糖各劑量組的ALT活力極顯著降低（P＜0.01），趨于正常水平。與模型組比較，陽性對照組和殼寡糖各劑量組AST活力顯著降低（P＜0.05），但和正常組比較有顯著性差異（P＜0.05）?？傊?，殼寡糖可抑制酒精引起的血清ALT、AST活力升高并改善肝功能。劉紅云等[12]報道殼寡糖組ALT、AST活力較酒精組極顯著降低，這與本研究結果一致。

酒精性脂肪肝與血脂有密切的關系。過量攝入酒精會導致肝臟脂質(zhì)的積累，如果肝臟發(fā)生脂肪病變，血脂濃度則會增加[15-16]。與正常組比較，模型組血清TC濃度極顯著升高（P＜0.01），表明酒精攝入可能引起膽固醇堆積并影響脂質(zhì)代謝。與模型組相比，殼寡糖組的血清TC濃度極顯著降低（P＜0.01），表明它可以改善脂肪堆積。劉亮亮等[3]報道與模型組相比，殼寡糖各劑量組均能顯著降低TC濃度，且與正常對照組比較差異不明顯，本研究結果與其一致。

2.3 殼寡糖對酒精性肝損傷小鼠肝臟SOD活力和GSH、MDA含量的影響

酒精會在人體的新陳代謝中產(chǎn)生大量的活性氧，影響機體的抗氧化系統(tǒng)，導致酒精性肝損傷，而體內(nèi)的抗氧化劑會保護細胞免受活性氧的影響，但這些抗氧化劑的活性很容易被過量的脂質(zhì)過氧化物清除，導致肝臟損傷[17]。

表2 殼寡糖對小鼠肝臟SOD活力和GSH、MDA含量的影響Table 2 Effect of COS on SOD activity and GSH and MDA contents in liver of mice

GSH和SOD在體內(nèi)氧化與抗氧化能力之間的平衡中起著重要作用[18]，由表2可知，與正常組相比，模型組的GSH含量、SOD活力均顯著降低（P＜0.05），這表明酒精引起小鼠肝臟中過氧化物水平的顯著增加，并且使抗氧化能力下降。與模型組相比，殼寡糖組GSH含量、SOD活力極顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，低劑量和高劑量殼寡糖組的MDA含量極顯著降低，而MDA是自由基作用于脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，通過測定MDA含量可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，它是膜脂質(zhì)過氧化的常用指標[19-20]。這表明，殼寡糖能有效防止酒精攝入引起的小鼠肝細胞過度氧化，增強機體抗氧化能力可能在酒精性肝損傷的保護中起重要作用。

圖2 殼寡糖對小鼠肝臟病理切片的影響（HE染色）(×100）Fig. 2 Photomicrographs of liver sections stained with hematoxylin and eosin (× 100)

由圖2可知，在正常組中，肝小葉的結構清楚，肝細胞呈放射狀排列且排列整齊，肝竇正常，細胞核結構清晰。相比之下，酒精灌胃后導致嚴重的肝損傷。模型組肝細胞排列無序，肝竇變窄、分散，而且可見點狀壞死和炎癥細胞。殼寡糖低劑量組和殼寡糖中劑量組肝細胞排列逐漸趨于整齊，但還可見少數(shù)炎癥細胞。在殼寡糖高劑量組中，肝細胞排列整齊，肝竇已恢復正常，炎癥細胞和點狀壞死細胞明顯減少，肝細胞霧化情況明顯減少。

3 討 論

本實驗結果表明，殼寡糖能顯著降低血清ALT、AST活力，改善肝功能；肝臟中肝臟系數(shù)、TC濃度、MDA含量也顯著降低，有效地減少了脂肪的積累；GSH含量和SOD活力則顯著增加，脂質(zhì)過氧化程度降低；觀察肝臟病理學切片可以明顯看到殼寡糖組肝細胞排列趨于整齊，說明殼寡糖能有效緩解酒精引起的肝臟損傷。

目前對宿醉和肝臟保護方面的機理研究主要是提高肝組織的抗氧化能力、消除氧自由基、減少脂質(zhì)過氧化、緩解脂肪堆積、調(diào)控代謝關鍵酶以及降低炎癥反應這幾個方面[21-22]。盡管酒精引起的肝毒性與不同的機制有關，但不斷有證據(jù)表明氧化應激在酒精性肝疾病及其發(fā)病機理中十分重要[23-26]，因為氧化應激會使肝功能紊亂，從而造成肝細胞損傷。氧化應激是指ROS產(chǎn)生及其消耗抗氧化防御系統(tǒng)，造成促氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡。本實驗中，殼寡糖組都顯著提高了肝臟SOD活力和GSH含量，表明殼寡糖可能可以抑制乙醇誘導的脂質(zhì)過氧化和谷胱甘肽降解，并通過抗氧化作用來降低酒精對肝臟的損害作用。殼寡糖的抗氧化作用與抗氧化基因有關，它包括血紅素氧化酶-1、絲裂原活化蛋白激酶、編碼還原型輔酶/醌氧化還原酶等[27-28]。另外，Arora等[29]研究表明酒精濫用會引起內(nèi)毒素血癥，轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活，釋放一些炎癥介質(zhì)（腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6），導致氧化應激，最終導致肝損傷。已有研究表明殼寡糖能有效地抑制炎癥激活因子NF-κB基因啟動子活性，也表明了殼寡糖對預防疾病相關的炎癥反應方面具有一定功效[30-31]。因此，可在后續(xù)研究中增加炎性反應因子及相關通路的檢測，繼續(xù)開展殼寡糖致酒精性肝損傷機制的相關研究工作。