焦 丹，李浩霞，吳丹丹，周中凱*

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457 ）

糖尿病是由胰島素（insulin，INS）分泌不足或INS抵抗導(dǎo)致的以高血糖為特征的一種慢性代謝疾病[1]，其發(fā)病率極高，可引起機(jī)體糖脂代謝紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變、腎功能衰竭、心血管病變等各種并發(fā)癥，極大地增加了糖尿病的死亡率[2]。目前糖尿病治療主要以西藥為主，但其存在著嚴(yán)重的副作用，因此，尋找天然有機(jī)功能因子替代當(dāng)前藥物治療具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

魔芋是一種多年生天南星科草本植物，其塊莖含有豐富的葡甘露聚糖[3]，是其主要的活性成分，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生物等領(lǐng)域[4-6]。魔芋低聚糖（konjac oligosaccharide，KOS）由魔芋葡甘露聚糖降解而成，具有降血糖、降血脂、清除自由基、提高機(jī)體抗氧化能力、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等生理功能[7-9]。楊艷燕等[9]的研究表明，KOS能降低小鼠的血糖水平、提高機(jī)體的抗氧化能力；劉瑞雪等[10]的研究表明KOS可明顯改善結(jié)腸炎大鼠的臨床癥狀；周中凱等[11]的研究表明KOS可改善肥胖小鼠脂代謝紊亂癥狀。

在分子水平上對糖尿病大鼠糖脂代謝基因表達(dá)已取得一些研究進(jìn)展：張汝學(xué)等[12]研究了地黃寡糖對糖尿病大鼠肝臟糖代謝關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)的影響；王曉鳳[13]通過基因表達(dá)研究了蕎麥殼中活性物質(zhì)對體內(nèi)外糖脂代謝的影響。雖然國內(nèi)外目前已有許多關(guān)于KOS可調(diào)節(jié)血糖、血脂、改善糖尿病癥狀的報(bào)道，但在分子水平上通過調(diào)控糖脂代謝及氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而緩解糖尿病癥狀的報(bào)道尚少。因此，本研究采用尾部靜脈注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）的方法誘導(dǎo)SD大鼠，建立糖尿病模型，通過對其體質(zhì)量、血糖濃度、血清脂質(zhì)組成以及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測定，分析KOS對糖尿病大鼠糖脂代謝及氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技術(shù)在分子水平上進(jìn)行作用機(jī)制的研究，以期為KOS改善糖尿病糖脂代謝紊亂癥狀提供更深入的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KOS由天津科技大學(xué)糧油科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室提供。雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK-（軍）2014-0001。

基礎(chǔ)飼料 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；STZ 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）試劑盒、甘油三酯（triacylglycerol，TG）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒、大鼠INS水平試劑盒 南京建成生物科技有限公司；PrimeScript RT Reagent Kit 大連寶生物工程有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MK-3酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Step one plus qPCR儀 美國ABI公司；智能培養(yǎng)箱寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器表有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將40 只SD雄性大鼠隨機(jī)分成4 組：正常組（NC）、糖尿病模型組（DC）、KOS低劑量組（L-KOS）、KOS高劑量組（H-KOS）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量。參照文獻(xiàn)[14-15]中糖尿病建模方法：尾靜脈注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% STZ（現(xiàn)用現(xiàn)配，冰浴；溶劑為0.1 mol/L pH 4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液），注射劑量為45 mg/kg，正常組注射等劑量的緩沖液。72 h后尾靜脈采血,用ONE-TOUCH血糖儀測隨機(jī)血糖濃度，以血糖濃度超過16.7 mmol/L作為大鼠建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。建模成功后每組9 只大鼠。L-KOS組每天灌胃36.14 mg/kg KOS，H-KOS組每天灌胃69.25 mg/kg KOS，正常組和糖尿病組給予同劑量的純凈水。各組大鼠均自由飲水、進(jìn)食，喂養(yǎng)4 周。4 周后禁食不禁水12 h，處死大鼠，股動(dòng)脈取血，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，取上層血清。解剖大鼠，取出肝臟稱質(zhì)量，快速放入液氮中冷凍，將血清與臟臟置于-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 指標(biāo)測定

1.3.2.1 大鼠體質(zhì)量和空腹血糖濃度的測定

每日對大鼠進(jìn)行臨床活動(dòng)度觀察，記錄各組大鼠每周的體質(zhì)量和空腹血糖濃度。

1.3.2.2 大鼠血清指標(biāo)的測定

取出備用血清，TG濃度、T-CHO濃度、LDL-C濃度、HDL-C濃度、T-AOC、T-SOD活力、GSH-Px活力、MDA濃度、INS水平測定均按照試劑盒的操作說明書進(jìn)行，每個(gè)樣品做3 次平行。

1.3.2.3 與糖代謝、脂代謝、氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)量的測定

取出肝臟樣品，使用TRIzol試劑進(jìn)行RNA提取。使用PrimeScript RTReagent Kit對cDNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄qPCR，以18S rDNA基因作內(nèi)參，每個(gè)基因做3 次平行，并根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量[16]?；蚺c引物見表1。

表1 基因和引物信息Table 1 Information about the genes and primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，顯著性采用方差分析和鄧肯氏（Duncan’s）差異顯著性分析，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 KOS對大鼠體質(zhì)量和空腹血糖濃度的影響

如圖1所示，各組大鼠初始體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05），說明大鼠實(shí)驗(yàn)分組合理。造模后，與NC組相比，KOS低、高劑量組大鼠體質(zhì)量增長速度緩慢（P＜0.05），而DC組大鼠體質(zhì)量增長速度不明顯，且后期有下降趨勢。KOS干預(yù)2 周后，與DC組相比，KOS高、低劑量組大鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05）；干預(yù)4 周后，與DC組相比，大鼠體質(zhì)量分別增加了32.05%、22.76%。這表明KOS具有減輕糖尿病大鼠體質(zhì)量下降趨勢的作用。

圖1 KOS對大鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of KOS on body mass of rats

表2 KOS對大鼠空腹血糖濃度的影響Table 2 Effect of KOS on fasting blood glucose of rats

如表2所示，各組初始空腹血糖濃度無顯著性差異，說明個(gè)體之間血糖濃度差異性不明顯。注射STZ 72 h后，大鼠的血糖濃度平均值大于16.7 mmol/L，表明造模成功。KOS干預(yù)1 周后，與DC組相比，KOS低、高劑量組的空腹血糖水平分別極顯著降低了33.14%、34.50%（P＜0.01）。治療4 周后，與造模72 h后血糖濃度相比，KOS低、高劑量組大鼠血糖水平分別降低了41.99%、39.32%。

2.2 KOS對大鼠INS水平的影響

圖2 KOS對大鼠INS水平的影響Fig. 2 Effect of KOS on INS levels of rats

如圖2所示，與NC組相比，DC組大鼠INS水平顯著降低（P＜0.05）。與DC組相比，KOS干預(yù)后2 組大鼠INS水平均顯著升高（P＜0.05），且能達(dá)到NC組正常水平（P＞0.05）。這說明KOS可促進(jìn)大鼠INS分泌，改善糖尿病癥狀。

2.3 KOS對大鼠血脂水平的影響

表3 KOS對大鼠血脂水平的影響Table 3 Effect of KOS on serum lipid levels in rats

如表3所示，與NC組相比，DC組大鼠的TG、T-CHO、LDL-C濃度均顯著增加，HDL-C濃度顯著降低（P＜0.05）。這說明糖尿病易造成大鼠脂代謝紊亂。KOS干預(yù)后，與DC組相比，H-KOS組大鼠的TG、T-CHO、LDL-C濃度顯著降低（P＜0.05），HDL-C濃度顯著升高（P＜0.05）。這說明高劑量的KOS干預(yù)對糖尿病大鼠脂代謝紊亂的改善作用顯著。

2.4 KOS對大鼠氧化應(yīng)激水平的影響

表4 KOS對大鼠氧化應(yīng)激水平的影響Table 4 Effect of KOS on oxidative stress levels of rats

如表4所示，與NC組相比，DC組的T-AOC、GSH-Px活力、T-SOD活力顯著降低（P＜0.05），MDA濃度顯著增加（P＜0.05），這說明糖尿病可使脂質(zhì)過氧化及氧自由基損傷程度加劇。KOS干預(yù)后，KOS低、高劑量組大鼠的抗氧化水平與DC組相比均得到改善，且能達(dá)到或高于NC組正常水平。MDA濃度作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo)之一，可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，KOS干預(yù)后H-KOS組大鼠的MDA濃度與DC組相比顯著降低。結(jié)果表明，KOS在一定程度上可抑制脂質(zhì)的過氧化，減少細(xì)胞受氧自由基的損傷，提高糖尿病大鼠的抗氧化應(yīng)激能力。

2.5 糖代謝、脂代謝、氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)量分析

2.5.1 KOS對大鼠糖代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

為進(jìn)一步了解KOS調(diào)節(jié)血糖濃度的分子機(jī)制，利用逆轉(zhuǎn)錄qPCR技術(shù)研究了大鼠肝臟中與糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。KOS干預(yù)后，與DC組相比，KOS低、高劑量組糖原合成基因GS2、GYG1的表達(dá)量顯著上升，糖異生基因G6PC1的表達(dá)量顯著降低，INS誘導(dǎo)基因Insig1、Insig2的表達(dá)量顯著上升，且均高于NC組，其中H-KOS組Insig2表達(dá)量上調(diào)至接近NC組的10 倍。這表明KOS干預(yù)后能促進(jìn)糖原的合成，抑制糖異生過程，誘導(dǎo)INS的合成和分泌，進(jìn)而降低血糖濃度。

圖3 KOS對大鼠糖代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig. 3 Effect of KOS on the expression of genes associated with glucose metabolism

2.5.2 KOS對大鼠脂代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

圖4 KOS對大鼠脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig. 4 Effect of KOS on the expression of genes associated with lipid metabolism

表3數(shù)據(jù)顯示，KOS干預(yù)可顯著改善糖尿病大鼠的血脂組成，為了進(jìn)一步研究KOS改善血脂的分子機(jī)制，利用逆轉(zhuǎn)錄qPCR技術(shù)研究了大鼠肝臟中與脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。ACC、FAS參與脂肪酸的合成[17]，SREBP-1主要促進(jìn)TG的合成。KOS干預(yù)后，與DC組相比，KOS低、高劑量組ACC、FAS、SREBP-1基因表達(dá)顯著下調(diào)，其中H-KOS組中FAS的表達(dá)量下調(diào)60%以上，這說明KOS干預(yù)可抑制脂肪酸、膽固醇和TG的生物合成路徑，改善糖尿病大鼠的血脂組成，緩解糖尿病癥狀。

2.5.3 KOS對大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的影響

如圖5所示，KOS干預(yù)后，與DC組相比，KOS低、高劑量組Hmox1、Egfr基因表達(dá)量顯著上調(diào)，其中L-KOS組中Egfr基因表達(dá)量上調(diào)超過2 倍，H-KOS組上調(diào)4 倍；L-KOS組中Hmox1的表達(dá)量高于H-KOS組，且接近DC組的4 倍。IGFBP-1基因表達(dá)量顯著降低。

圖5 KOS對大鼠氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig. 5 Effect of KOS on the expression of genes associated with oxidative stress

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以SD雄性大鼠為研究對象，尾靜脈注射STZ誘導(dǎo)糖尿病模型。探討KOS對糖尿病大鼠糖脂代謝及氧化應(yīng)激水平的影響。

結(jié)果表明，與NC組相比，糖尿病可使大鼠體質(zhì)量減輕、空腹血糖濃度升高。與DC組相比，KOS干預(yù)治療可有效增加糖尿病大鼠的體質(zhì)量（H-KOS組體質(zhì)量增加32.05%），顯著降低其空腹血糖濃度，這說明KOS對糖尿病大鼠的治療起到了積極的作用。糖尿病會(huì)導(dǎo)致大鼠血液中T-CHO、TG和LDL-C的含量增加，并使HDL-C含量顯著降低，進(jìn)而導(dǎo)致血脂代謝紊亂[18-19]。KOS干預(yù)后，與DC組相比，大鼠血清中T-CHO、TG和LDL-C濃度顯著降低，HDL-C濃度顯著升高。這說明KOS可調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂，進(jìn)而緩解糖尿病癥狀。此外，KOS可提高機(jī)體的INS水平，進(jìn)而改善血糖濃度。

有研究表明，糖尿病糖脂代謝紊亂會(huì)打破過氧化和抗氧化之間的平衡，從而降低機(jī)體抗氧化能力[20]。而自由基的形成和機(jī)體的天然抗氧化能力不平衡被認(rèn)為是誘發(fā)糖尿病的根源[21]。GSH-Px能特異地催化還原型谷胱甘肽對氫過氧化物的還原反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整。MDA的含量可直接反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)的過氧化程度。T-SOD是促氧化-抗氧化平衡中至關(guān)重要的酶。糖尿病會(huì)顯著降低大鼠的T-AOC、T-SOD和GSH-Px活力，增加MDA含量，增強(qiáng)氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷。KOS干預(yù)后，與DC組相比，KOS低、高劑量組大鼠的T-AOC、T-SOD和GSH-Px活力顯著提高，MDA濃度降低，說明KOS能抑制糖尿病引起的機(jī)體氧化應(yīng)激損傷。

為了進(jìn)一步研究KOS調(diào)節(jié)糖尿病大鼠糖脂代謝和氧化應(yīng)激的分子機(jī)制，通過逆轉(zhuǎn)錄qRCR分析了與糖脂代謝及氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)水平。GS2是谷氨酰胺合成酶，谷氨酰胺含量的增加能促進(jìn)糖原的合成[22]，GYG1同樣也可以促進(jìn)糖原的合成。KOS干預(yù)后，相對于DC組，KOS低、高劑量組大鼠GS2的表達(dá)量上升，其中L-KOS組上調(diào)了0.35 倍，優(yōu)于H-KOS組。這說明KOS可促進(jìn)肝糖原的合成，降低血糖濃度。G6PC1是糖異生最終反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控酶[23]，KOS干預(yù)后，相對于DC組，H-KOS組中G6PC1的表達(dá)量下調(diào)了0.53 倍，因此大鼠血糖濃度的下降也可能與糖異生的抑制有關(guān)。Insig1、Insig2是INS誘導(dǎo)基因，不但在糖代謝平衡中具有重要作用[24]，同時(shí)也能調(diào)節(jié)膽固醇和脂類代謝[12]。KOS干預(yù)后，相對于DC組，2 種INS誘導(dǎo)基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，其中H-KOS組中Insig1表達(dá)量上調(diào)1 倍，Insig2表達(dá)量上調(diào)9 倍。Insig1或Insig2的過度表達(dá)也可抑制肝臟中SREBP-1蛋白的活化，減少機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)沉積[25-26]，這與低、高劑量KOS干預(yù)后大鼠SREBP-1表達(dá)量顯著降低的結(jié)果一致。此外，ACC和FAS的表達(dá)也與SREBP-1有關(guān)，SREBP-1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與脂代謝相關(guān)的基因，主要促進(jìn)TG的合成，激活后可促進(jìn)FAS、ACC基因的過量表達(dá)，最終增加脂質(zhì)沉積量[27-28]。KOS干預(yù)后，與DC組相比，KOS低、高劑量組中FAS、ACC的表達(dá)量顯著下調(diào)，其中FAS的下調(diào)量超過60%。這說明KOS干預(yù)可抑制脂肪酸、膽固醇和TG的生物合成路徑，從而改善糖尿病大鼠的血脂組成。Egfr的高表達(dá)量能顯著改善糖尿病大鼠的病理癥狀，提高機(jī)體的抗氧化能力[29]。KOS干預(yù)后，相對于DC組，H-KOS組中Egfr表達(dá)量上調(diào)4 倍。IGFBP-1是能與胰島素樣生長因子結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白，能夠競爭性抑制其與受體的結(jié)合，從而抑制其生理活性[30]。KOS干預(yù)后能顯著降低KOS低、高劑量組大鼠IGFBP-1表達(dá)量。另外，KOS干預(yù)也可使Hmox1表達(dá)量顯著上升。說明KOS可通過增加Egfr、Hmox1的表達(dá)量提高糖尿病大鼠機(jī)體的抗氧化能力。

綜上所述，KOS可通過促進(jìn)糖原合成和抑制糖異生來調(diào)節(jié)大鼠血糖濃度，并且通過抑制脂肪酸、膽固醇和TG的生物合成途徑來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制糖尿病引起的氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。