李漢卿,劉豐銘,單樹花,魯 洋,張曉莉,李卓玉,,*
(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006 ;2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006 )
動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要誘因之一,是一種多因素導(dǎo)致的慢性疾病,動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病誘因主要有2 個(gè)方面:一方面為血管內(nèi)膽固醇等脂質(zhì)的積累,逐漸引起動(dòng)脈粥樣硬化,導(dǎo)致腦中風(fēng)和冠心病等[1-2];另一方面為機(jī)械、炎癥等原因?qū)е卵軆?nèi)皮損傷[3]。人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)是主動(dòng)脈中膜的主要組成部分[4],存在收縮型和合成型2 種不同表型:收縮型分化程度高,細(xì)胞呈紡錘樣細(xì)長(zhǎng)梭形,增殖和遷移能力較弱,正常成熟血管壁表現(xiàn)為該類型[5-7];而合成型分化程度較低,細(xì)胞肥大呈峰谷狀生長(zhǎng),增殖和遷移能力較強(qiáng)。動(dòng)脈粥樣硬化中期形成動(dòng)脈粥樣斑塊,主要是HASMC由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型后,合成型的血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)過損傷的內(nèi)膜,從血管壁中層遷移到內(nèi)膜。遷移后合成型的血管平滑肌細(xì)胞增殖并吞噬低密度脂蛋白[8-10]等脂類蛋白,形成血管平滑肌細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞[11],從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程,引發(fā)心腦血管疾病。由此可見,HASMC表型轉(zhuǎn)化是促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素,也是當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一。
酸棗(Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chow)別名野棗,棗屬植物,是棗的原生種,在我國(guó)分布較廣[12-13],是生長(zhǎng)于我國(guó)北方的野生藥用植物資源,有著很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,富含糖、有機(jī)酸、維生素和多種酚類化合物[14]。研究表明,酸棗仁味甘性平,具有安神鎮(zhèn)靜作用,富含脂肪酸類、三萜類和黃酮類等成分,是治療動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管疾病的高頻藥物之一[15-16];酸棗葉中提取到的酸葉酮、蘆丁等成分可以治療冠心病等心腦血管疾病;酸棗肉中富含許多可溶性糖、多種有機(jī)酸、礦質(zhì)元素[17]和氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分,對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的治療也有一定作用。近年來,有研究證明酸棗具有防病抗衰老與延年益壽的作用[18],這些與酸棗中的多酚類物質(zhì)密不可分。
本實(shí)驗(yàn)以酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉為原材料,運(yùn)用不同方法提取自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚,對(duì)其不同方法提取的多酚質(zhì)量濃度進(jìn)行了測(cè)定,并研究了各種多酚對(duì)HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響,為動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供一定的理論參考。
酸棗葉、酸棗肉和酸棗仁 國(guó)藥控股國(guó)大藥房山西益源連鎖有限公司。
HASMC 美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫;DMEM/F-12(HAM)1∶1培養(yǎng)基 美國(guó)Biological Industries公司;無支原體胎牛血清 美國(guó)Gibco公司;噻唑藍(lán)、福林-酚試劑、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標(biāo)記鬼筆環(huán)肽、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI) 北京索萊寶科技公司;二甲基亞砜 美國(guó)Amresco公司;胰蛋白酶 北方同正公司;血管緊張素II(angiotensin II,AngII) 上海阿拉丁試劑有限公司;乙醇、碳酸鈉、沒食子酸、氫氧化鈉等均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>
5417離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;756MC型紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;Milli-QA10超純水儀、超濾管 美國(guó)Millipore公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermo公司;Delta Vision Elite系統(tǒng) 美國(guó)Applied Precision公司;倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司;真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Hyclone公司。
1.3.1 酸棗多酚的有機(jī)溶劑法提取
樣品預(yù)處理:酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉用組織研磨儀粉碎為粉末狀。
自由態(tài)多酚提?。悍謩e稱取酸棗肉粉、酸棗仁粉和酸棗葉粉各10 g,加入適量預(yù)熱的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液,攪拌均勻后靜提1 h,然后將混合物5 000 r/min離心10 min,收集上清液。重復(fù)上述方法,收集上清液。將2 次收集的上清液混合后在80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡乙醇,最后用冷凍干燥機(jī)將其冷凍干燥即相應(yīng)為酸棗肉自由態(tài)多酚(Ziziphus jujuba flesh free polyphenol-ethyl alcohol,ZSFFP-E)、酸棗仁自由態(tài)多酚(Ziziphus jujuba seeds free polyphenolethyl alcohol,ZSSFP-E)、酸棗葉自由態(tài)多酚(Ziziphus jujuba leaves free polyphenol-ethyl alcohol,ZSLFP-E)。在-20 ℃保存,使用時(shí)用超純水溶解。
結(jié)合態(tài)多酚提?。簩⑻崛⊥曜杂蓱B(tài)多酚的酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉沉淀按如下2 種方法消化:1)加入100 mL NaOH消化;2)加入100 mL的甲醇和濃硫酸配制的混合溶液消化,在室溫下用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢? h,然后在混合物中加入適量HCl,調(diào)pH值至7,終止消化。然后將混合物在11 000 r/min離心10 min,取上清液。在上清液中加入等體積的乙酸乙酯后充分?jǐn)嚢瑁?1 000 r/min離心10 min,重復(fù)5 次充分除脂。將多酚提取液在70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡有機(jī)溶劑后停止,最后用冷凍干燥機(jī)將其冷凍干燥,分別得到6 種結(jié)合態(tài)多酚:酸棗肉結(jié)合態(tài)多酚-法1(ZSFBP-1-E)、酸棗仁結(jié)合態(tài)多酚-法1(ZSSBP-1-E)、酸棗葉結(jié)合態(tài)多酚-法1(ZSLBP-1-E)、酸棗肉結(jié)合態(tài)多酚-法2(ZSFBP-2-E)、酸棗仁結(jié)合態(tài)多酚-法2(ZSSBP-2-E)、酸棗葉結(jié)合態(tài)多酚-法2(ZSLBP-2-E)。在-20 ℃保存,使用時(shí)用超純水溶解。
1.3.2 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉中多酚質(zhì)量濃度的測(cè)定
采用福林-酚比色法,以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度分別為0、20、60、100、150、200、300、400、500、600 μg/mL。將1 mL樣品移入離心管,12 000×g離心15 min。加100 μL標(biāo)準(zhǔn)液或樣品和400 μL去離子水到試管中。加100 μL福林-酚試劑,混勻靜置6 min。然后加1 mL的7% Na2CO3和0.8 mL去離子水,混勻靜置90 min。用紫外-可見分光光度計(jì)在760 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo),沒食子酸質(zhì)量(mg)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.443 1x+0.016 1(R2=0.998 9),通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多酚的質(zhì)量濃度。
1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)
HASMC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F-12(HAM)1∶1培養(yǎng)基中,置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液,采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù),用無血清培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋細(xì)胞濃度至5 000 個(gè)/孔,接種到96 孔板中饑餓處理24 h,使細(xì)胞周期同步。然后棄去舊培養(yǎng)基,每孔加入100 μL含有多酚和10-6mol/L AngII的完全培養(yǎng)基,每種多酚設(shè)置5 個(gè)平行孔,待處理24、48 h后,在倒置顯微鏡下觀察HASMC的表型轉(zhuǎn)化情況,并在拍照視野內(nèi)隨機(jī)選取50 個(gè)細(xì)胞測(cè)量其長(zhǎng)度和寬度,求其平均值。
1.3.5 細(xì)胞熒光染色觀察
將蓋玻片酸泡過夜,蒸餾水沖洗干凈,浸泡于體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中,使用時(shí)將蓋玻片上乙醇燒干,鋪于12 孔板中,將用無血清培養(yǎng)基稀釋好的濃度為20 000 個(gè)/mL的HASMC鋪于12 孔板中,饑餓處理24 h。待處理完成后棄掉無血清培養(yǎng)基,分別加入1 mL含10-6mol/L AngII的完全培養(yǎng)基,然后加入ZSSBP-2-E、ZSLFP-E,終質(zhì)量濃度分別為0.15、1.5 mg/mL,處理48 h。吸棄培養(yǎng)基,用37 ℃預(yù)熱的pH 7.4磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2 次,每孔加入600 μL免疫熒光固定液固定10 min,用PBS清洗3 次,每次輕搖5 min。每孔加入500 μL 0.5% TritionX-100溶液透化處理5 min,用PBS清洗3 次,每次輕搖5 min。每孔加200 μL 100 nmol/L FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液,室溫避光孵育30 min,用PBS清洗3 次,每次輕搖5 min。每孔加200 μL 100 nmol/L DAPI溶液,室溫避光孵育30 min,用PBS清洗3 次,每次輕搖5 min。在載玻片中央滴加適量抗熒光猝滅劑,將蓋玻片從12 孔板中取出倒置在載玻片上,封片劑封片后用Delta Vision Elite系統(tǒng)觀察HASMC表型轉(zhuǎn)化情況。
所有數(shù)據(jù)均為3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,組間差異分析采用t檢驗(yàn),P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。
表1 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉中自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚質(zhì)量濃度Table 1 Contents of free and bound polyphenols in the flesh,seeds and leaves
由表1可知,酸棗葉中多酚質(zhì)量濃度排序依次為:ZSLFP-E>ZSLBP-2-E>ZSLBP-1-E;酸棗肉中多酚質(zhì)量濃度排序依次為:ZSFFP-E>ZSFBP-1-E>ZSFBP-2-E;酸棗仁中多酚質(zhì)量濃度排序依次為:ZSSFP-E>ZSSBP-1-E>ZSSBP-2-E。酸棗肉、酸棗仁和酸棗葉中自由態(tài)多酚質(zhì)量濃度均高于結(jié)合態(tài)多酚。自由態(tài)多酚中ZSLFP-E得率最高,結(jié)合態(tài)多酚中ZSLBP-2-E得率最高。
圖1 倒置顯微鏡下觀察6 種結(jié)合態(tài)多酚對(duì)HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響(24 h)Fig. 1 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with six kinds of bound polyphenols under an inverted microscope (24 h)
表2 圖1中細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度Table 2 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 1
圖2 倒置顯微鏡下觀察6 種結(jié)合態(tài)多酚對(duì)HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響(48 h)Fig. 2 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with six kinds of bound polyphenols under an inverted microscope (48 h)
表3 圖2中細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度Table 3 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 2
圖3 倒置顯微鏡下觀察3 種自由態(tài)多酚對(duì)HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響(24 h)Fig. 3 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with three kinds of free polyphenols under an inverted microscope (24 h)
表4 圖3中細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度Table 4 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 3
圖4 倒置顯微鏡下觀察3 種自由態(tài)多酚對(duì)HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響(48 h)Fig. 4 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with three kinds of free polyphenols under an inverted microscope (48 h)
表5 圖4中細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度Table 5 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 4
用提取的9 種多酚(終質(zhì)量濃度0.25 mg/mL)分別處理HASMC 24、48 h并觀察其表型轉(zhuǎn)化。6 種結(jié)合態(tài)多酚處理組與對(duì)照組、AngII處理組對(duì)比,ZSSBP-2-E處理組的HASMC形態(tài)明顯向收縮型轉(zhuǎn)變(圖1、表2),ZSLBP-1-E影響HASMC的存活率,因此未統(tǒng)計(jì)HASMC細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變;隨時(shí)間的延長(zhǎng),ZSSBP-2-E處理組的HASMC形態(tài)進(jìn)一步向收縮型轉(zhuǎn)變(圖2、表3);3 種自由態(tài)多酚處理組與對(duì)照組、AngII處理組對(duì)比,ZSLFP-E處理組的HASMC形態(tài)明顯向收縮型轉(zhuǎn)變(圖3、表4);隨時(shí)間的延長(zhǎng),ZSLFP-E處理組的HASMC形態(tài)進(jìn)一步向收縮型轉(zhuǎn)變(圖4、表5)。以上結(jié)果表明,9 種多酚中,ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可以使HASMC明顯由合成型轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s型,并且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。
圖5 倒置顯微鏡觀察ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對(duì)HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響Fig. 5 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with under an inverted microscope
表6 圖5中細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度Table 6 Measurement results of the length and width of cells in Fig. 5
為了解不同質(zhì)量濃度的ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對(duì)HASMC形態(tài)的影響,用不同質(zhì)量濃度梯度的ZSSBP-2-E和ZSLFP-E處理HASMC并觀察其表型轉(zhuǎn)化,隨著ZSSBP-2-E和ZSLFP-E質(zhì)量濃度的增加,HASMC形態(tài)向收縮型轉(zhuǎn)變更加明顯(圖5、表6),同時(shí)隨著ZSSBP-2-E和ZSLFP-E質(zhì)量濃度的增加,收縮型細(xì)胞數(shù)量在增加。以上結(jié)果表明:ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可以使HASMC由合成型轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s型,并且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度梯度依賴性。
圖6 Delta Vision Elite觀察ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對(duì)HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響Fig. 6 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with free polyphenols from leaves and bound polyphenols from seeds obtained by acid digestion under Delta Vision Elite system
為了更加直觀地觀察ZSLFP-E和ZSSBP-2-E對(duì)HASMC表型的轉(zhuǎn)化作用,用FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽對(duì)HASMC細(xì)胞骨架進(jìn)行染色,用DAPI對(duì)HASMC細(xì)胞核進(jìn)行染色,通過Delta Vision Elite系統(tǒng)觀察HASMC形態(tài)。由圖6可知,用ZSLFP-E和ZSSBP-2-E兩種藥物分別處理HASMC后,細(xì)胞形態(tài)明顯向收縮型轉(zhuǎn)變。
動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性疾病,其發(fā)病誘因多種多樣,如不良習(xí)慣、肥胖、高血壓、糖尿病等[19-22],而HASMC的形態(tài)變化是重要內(nèi)因之一。HASMC存在收縮型和合成型2 種不同表型,收縮型增殖、遷移能力較弱,細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘樣細(xì)長(zhǎng)梭形,合成型細(xì)胞增殖、遷移能力較強(qiáng),細(xì)胞肥大呈峰谷狀生長(zhǎng)。不同的刺激可能引起HASMC由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?,并開始遷移、增殖,從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[23]。近幾年來,對(duì)于HASMC表型轉(zhuǎn)化的研究是熱門之一,植物中有效成分對(duì)于HASMC表型的轉(zhuǎn)化已有很多報(bào)道,如具有降血壓、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等作用的姜黃素[24-25],可以促進(jìn)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞由合成型向收縮型轉(zhuǎn)變[26]。而多酚對(duì)于影響HASMC表型轉(zhuǎn)變的研究也有許多。如鄔秋德等[27]的研究表明黃酒多酚可以抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化,從而能夠預(yù)防一些心血管疾病的發(fā)生。
因此,本實(shí)驗(yàn)通過不同方法提取酸棗不同部位(酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉)的自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚,并用提取的多酚進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),研究其對(duì)HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響。首先通過多酚的提取和測(cè)定,發(fā)現(xiàn)酸棗葉中的自由態(tài)多酚質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于其他部位提取的自由態(tài)多酚,且酸棗葉中用甲醇和濃硫酸混合液消化法提取的結(jié)合態(tài)多酚質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于其他部位提取的結(jié)合態(tài)多酚。在所提取的9 種多酚中,ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可明顯促進(jìn)HASMC由合成型向收縮型轉(zhuǎn)變,且呈現(xiàn)良好的時(shí)間和劑量依賴性。因此,這兩種多酚對(duì)于實(shí)際生活中預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化有很好的研究?jī)r(jià)值。未來可針對(duì)這兩種藥物深入探討其發(fā)揮功效的單一組分,并且研究其影響HASMC形態(tài)調(diào)控的基因,以期提供低毒、高效的預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的保健品和新型藥物。