周子維，游芳寧，劉彬彬，鄧婷婷，賴鐘雄，孫 云,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002 ；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002 ）

做青是烏龍茶品質(zhì)形成的核心工藝，是對(duì)青葉進(jìn)行反復(fù)的搖青和攤放的過程。搖青機(jī)械力是運(yùn)動(dòng)力和摩擦力內(nèi)外效應(yīng)的作用，使青葉香氣由青氣轉(zhuǎn)變?yōu)榛ü鉡1]。香氣是茶葉感官品質(zhì)的重要因子，除鮮葉所固有的游離態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)外，更多香氣物質(zhì)由對(duì)鮮葉采后加工處理所形成。目前，茶樹鮮葉中已被分離鑒定的揮發(fā)性物質(zhì)約有80余種，綠茶中有200余種，紅茶、烏龍茶均約有300余種[2]。茶樹鮮葉中的脂類物質(zhì)包括了脂肪酸、磷脂、甘油酯、糖脂等，約占干質(zhì)量8%[3]，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，以亞油酸和亞麻酸為代表的長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸能作為脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）代謝途徑的底物，在相關(guān)酶的催化下，形成大量脂肪族類香氣物質(zhì)[4-6]。引起脂肪酸酶促氧化反應(yīng)的酶系統(tǒng)定位在葉綠體中，主要包括LOX、氫氧化裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）以及醇?；D(zhuǎn)移酶（alcohol acyltransferases，AAT）等[7]。不飽和脂肪酸在LOX的作用下氧化成為過氧化物，過氧化物在HPL的進(jìn)一步氧化裂解下生成C6醛類，C6醛類被ADH還原成為相應(yīng)的醇類物質(zhì)，而后部分醇類物質(zhì)在AAT作用下開始發(fā)生酯化反應(yīng)，形成帶有花果香的葉醇酯類衍生物，除C6醛類物質(zhì)外，LOX/HPL系統(tǒng)的產(chǎn)物還有12-氧代-9(Z)-月桂烯酸，該物質(zhì)又會(huì)在?3-?2-烯酰-輔酶A異構(gòu)酶（?3-?2-enoyl-CoA isomerase，ECI）的作用下最終形成反式-2-十二碳烯二酸，即愈傷酸（圖1），它是植物響應(yīng)外界損傷而轉(zhuǎn)錄相關(guān)抗性基因的信號(hào)分子[8]。脂肪族的醇類、醛類、酮類等物質(zhì)，因低沸點(diǎn)、易揮發(fā)而受關(guān)注度較低，但脂肪族類香氣在烏龍茶做青[9]、紅茶萎凋[10]、綠茶攤放[11]等工藝過程中，脂肪酸發(fā)生裂解變化，為其他高沸點(diǎn)香氣的形成提供良好的基礎(chǔ)，另一方面脂肪酸氧化降解的程度，也能影響成茶貯藏期間的品質(zhì)變化。

圖1 不飽和脂肪酸的脂肪氧合酶代謝通路Fig. 1 LOX pathway of unsaturated fatty acids

作為植物抗逆生理中重要的應(yīng)答機(jī)制，茶樹LOX代謝途徑的相關(guān)基因研究目前以防治茶樹病蟲害居多[12-14]，已登錄的相關(guān)基因主要有：LOX1（EU195885）、LOX2（FJ418174）、LOX3（FJ794853）、LOX4（HM370508）、HPL（HM440156.1）及ADH（HM440157.1）。LOX是LOX代謝途徑的關(guān)鍵限速酶，它與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、防御等密切相關(guān)[15]。LOX根據(jù)酶裂解位點(diǎn)的差異被分為9-LOX和13-LOX亞族兩類，亞族間在功能和結(jié)構(gòu)上存在明顯差異[16]。HPL被認(rèn)為是細(xì)胞色素P450酶中的特殊類型，專一裂解LOX產(chǎn)物，與植物抗病、抗蟲以及特異氣味的形成有關(guān)[17-18]。Matsui等[19]對(duì)從茶樹葉片膜結(jié)構(gòu)中純化獲得的兩種形態(tài)的HPL進(jìn)行研究，比較了13-HPL對(duì)不同脂肪酸底物的反應(yīng)活性。相關(guān)研究表明，LOX/HPL系統(tǒng)在植物種子萌發(fā)[20]、果實(shí)成熟[21-23]、逆境脅迫[24-25]等過程中發(fā)揮重要作用。ADH是一種廣泛專一性含鋅金屬酶，在動(dòng)植物體內(nèi)醇類代謝中起關(guān)鍵作用，它將LOX/HPL系統(tǒng)生成的醛類還原為醇類，分為ADH1和ADH2兩種類型[26]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，茶樹ADH基因能響應(yīng)蟲害脅迫和機(jī)械損傷[27-28]。然而，在茶葉生產(chǎn)加工過程中，在搖青機(jī)械力處理下，茶葉中脂肪族類代謝物及相關(guān)基因表達(dá)模式的研究鮮見報(bào)道。

本研究以烏龍茶品種毛蟹為材料，為突顯搖青機(jī)械力的作用，設(shè)置等時(shí)間未搖青的攤放葉組，通過對(duì)離體茶樹鮮葉、搖青葉、攤放葉3 種不同葉態(tài)中脂肪族類代謝物質(zhì)差異和LOX代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量的變化，分析搖青機(jī)械力對(duì)脂肪族類香氣形成與相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性，闡釋離體葉片中脂肪族類香氣物質(zhì)形成的分子機(jī)理，為烏龍茶加工過程中香氣品質(zhì)的形成研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料為種植于福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)茶場(chǎng)的烏龍茶品種毛蟹（Camellia sinensis cv. Maoxie）。采摘時(shí)間為2017年10月上旬，采摘標(biāo)準(zhǔn)為當(dāng)年生長(zhǎng)無病蟲害的一芽三四葉。

亞油酸（色譜純）、亞麻酸（色譜純） 美國Sigma公司；愈傷酸（標(biāo)準(zhǔn)品） 東京TCI公司；總RNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量使用試劑 日本Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6CYQT-60型搖青機(jī)、LGJ-25C型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)生物制藥有限公司；超高效液相色譜儀 美國Waters公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國鉑金埃爾默公司；高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉的處理及分組

如圖2所示，在對(duì)鮮葉（XY）適度萎凋至含水率為72%后，將萎凋葉（1 000 g）均分為兩組，實(shí)驗(yàn)組采用烏龍茶做青工藝對(duì)日光萎凋葉進(jìn)行4 次搖青處理，每次搖青時(shí)間為3 min，期間每次攤放30 min，搖青桶轉(zhuǎn)速控制為40 r/min，做青過程總歷時(shí)為180 min，以鮮葉呈湯匙狀、綠葉紅邊明顯、花果香濃郁為標(biāo)準(zhǔn)做青葉（YQ）；同時(shí)在相同環(huán)境條件下設(shè)置對(duì)照組，即將另一組萎凋葉進(jìn)行無搖青的攤放處理，作為等時(shí)的攤放葉（TF）。對(duì)每次處理的取樣進(jìn)行3 次重復(fù)，用錫箔紙包好，采用液氮固樣法進(jìn)行固樣，固樣后樣品放置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 烏龍茶加工過程中不同處理下的葉態(tài)Fig. 2 Turning-over and spreading of tea leaves during oolong tea processing

1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定不飽和脂肪酸及愈傷酸

液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）條件參照文獻(xiàn)[29]。

樣品預(yù)處理：取冷凍干燥后樣品50 mg，加入500 μL試劑1（V（異丙醇）：V（水）：V（阿魏酸）＝2：1：0.002），加入2 顆預(yù)冷鋼珠，研磨2 min，-20 ℃放置20 min，冰浴中超聲30 min，加入1 mL氯仿，-20 ℃放置20 min，冰浴中超聲5 min，漩渦振蕩1 min，13 000 r/min離心5 min，取下層900 μL，揮干，1 mL甲醇超聲復(fù)溶1 min，樣品存放于-20 ℃待測(cè)。

采用BEH C8色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；氣簾氣35 psi；離子噴霧電壓-4 500 V；溫度350 ℃；離子源Gas1：30、Gas2：40；流動(dòng)相B（10 mmol/L甲酸銨水溶液，含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸），流動(dòng)相A（乙腈），采用等度洗脫。在Analyst軟件中采用默認(rèn)參數(shù)對(duì)各MRM transition進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和積分。樣本濃度計(jì)算：將樣品分析物的質(zhì)譜峰面積，代入線性方程中計(jì)算。

1.3.3 頂空萃取條件

頂空瓶加熱溫度80 ℃；取樣針溫度100 ℃；樣品瓶平衡溫度150 ℃；樣品平衡時(shí)間5 min；進(jìn)樣時(shí)間1.0 min；加壓時(shí)間2.0 min；拔針時(shí)間0.5 min。

1.3.4 氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定脂肪族類香氣成分

氣相色譜-質(zhì)譜條件參照文獻(xiàn)[30]。采用VF-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。進(jìn)樣口溫度：250 ℃，升溫程序：初始溫度40 ℃保持5 min，以2 ℃/min升至70 ℃，再以10 ℃/min升至230 ℃；載氣為氦氣，純度99.99%；質(zhì)譜接口溫度250 ℃、傳輸線溫度120 ℃；離子方式EI源，離子源溫度200 ℃；檢測(cè)器電壓70 eV；采用全掃描模式，掃描范圍45～500 amu。測(cè)定數(shù)據(jù)由儀器自帶軟件進(jìn)行分析處理，將茶葉樣品中脂肪族揮發(fā)性組分與NIST庫分析比較后，將峰面積大于1%的色譜峰作為有效觀測(cè)值，以歸一法確定各個(gè)物質(zhì)的含量。

1.3.5 葉片中總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取0.5 g供試材料，利用RNAprep Pure Plant Kit提取樣品的總RNA，用1.2%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并檢測(cè)其吸光度及濃度，用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.6 qPCR檢測(cè)

以不同葉態(tài)的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，利用qPCR技術(shù)對(duì)不同葉態(tài)中的脂肪酸代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析。采用DNAMAN 6.0軟件設(shè)計(jì)茶樹ADH基因的qPCR引物（表1），以茶樹GAPDH為內(nèi)標(biāo)基因[31]。反應(yīng)體系20 μL：1.0 μL 4×diluted cDNA，10 μL SYBR II，0.8 μL上、下游引物和7.4 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：95℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。采用2-△△Ct分別計(jì)算出相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量[32]。

表1 茶樹中脂肪酸代謝途徑相關(guān)酶基因的引物Table 1 Primer sequences used for qPCR ampli fi cation of fatty acid metabolism-related genes in tea tree

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

顯著性分析采用SPSS 18.0軟件中的單因素方差分析最小顯著差異法，P＜0.05表示差異顯著。相關(guān)性分析采用SPSS 18.0軟件中雙變量相關(guān)性檢測(cè)，以Pearson相關(guān)系數(shù)衡量變量間的線性關(guān)系，顯著性采用雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖青機(jī)械力對(duì)不飽和脂肪酸的影響

圖3 不同葉態(tài)中亞麻酸（A）、亞油酸（B）的含量變化Fig. 3 Changes in linolenic acid (A) and linoleic acid (B) content in different kinds of tea leaves

作為L(zhǎng)OX代謝途徑上重要的前體物質(zhì)，亞麻酸和亞油酸在LOX的作用下氧化降解后生成脂肪族類揮發(fā)物質(zhì)。LC-MS對(duì)樣品中靶向代謝物的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，鮮葉中的亞油酸（0.614 mg/g）和亞麻酸（0.227 mg/g）含量最高，在搖青機(jī)械力處理后含量驟減，分別降低了17.98%、21.52%，搖青葉中的亞麻酸和亞油酸的含量與鮮葉中的差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），攤放處理下亞麻酸和亞油酸的含量分別降低了10.86%、20.71%，但攤放葉中僅亞油酸含量與鮮葉差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。

2.2 搖青機(jī)械力對(duì)脂肪族類香氣的影響

圖4 不同葉態(tài)揮發(fā)性組分的峰面積Fig. 4 Peak proportions of volatile components in different kinds of tea leaves

圖5 不同葉態(tài)C6醛類（A）、C6醇類（B）、葉醇酯類衍生物（C）的變化Fig. 5 Changes in C6 aldehyde (A), C6 alcohol (B) and leaf alcohol ester derivatives (C) in different kinds of tea leaves

實(shí)驗(yàn)得到不同葉態(tài)不同揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積如圖4、5所示，從中篩選獲得脂肪族類香氣物質(zhì)，根據(jù)物質(zhì)差異分為C6醛、C6醇以及葉醇酯類衍生物3 類。

脂肪族醛類是茶葉清香氣味的重要成分之一，以C6醛類含量最為豐富，占茶葉芳香油含量的5%。鮮葉中測(cè)得C6醛主要有正己醛（22.53%）和青葉醛（29.46%）。與鮮葉相比，在機(jī)械力處理下的搖青葉中正己醛（4.82%）、青葉醛（10.57%）相對(duì)含量分別減少了78.60%和64.12%，而攤放葉中正己醛（6.46%）、青葉醛（13.44%）的相對(duì)含量也減少了71.33%和54.38%。

脂肪族醇類沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，具有強(qiáng)烈的青草氣。在鮮葉中未測(cè)得相應(yīng)的C6醇類物質(zhì)，搖青葉中檢測(cè)到含有正己醇（1.20%）、反-2-己烯醇（0.48%）、反-3-己烯醇（0.30%）以及反-4-己烯醇（3.75%），而攤放葉中僅測(cè)得反-2-己烯醇（0.47%）。

脂肪族醇會(huì)進(jìn)一步酯化成為具有水果清香的葉醇酯類物質(zhì)。鮮葉僅測(cè)得乙酸葉醇酯（0.83%），在機(jī)械力作用下?lián)u青葉中的葉醇酯類衍生物有乙酸葉醇酯（2.97%）、丁酸葉醇酯（3.15%）、己酸葉醇酯（1.06%）、苯甲酸葉醇酯（0.41%）、異戊酸葉醇酯（0.39%）及丁酸己酯（0.26%），攤放葉中測(cè)得的葉醇酯類衍生物有丁酸葉醇酯（0.29%）、己酸葉醇酯（0.22%）及異戊酸葉醇酯（0.14%）。機(jī)械力作用下，搖青葉中的葉醇酯類衍生物在類型和含量上都明顯增多，其中苯甲酸葉醇酯、丁酸己酯僅在搖青葉中測(cè)得，搖青葉中乙酸葉醇酯的含量相比鮮葉增多了257.83%，丁酸葉醇酯、己酸葉醇酯、異戊酸葉醇酯比攤放葉中分別增多了986.20 %、381.82 %以及178.57 %。

2.3 搖青機(jī)械力作用下脂肪酸代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)量

圖6 不同葉態(tài)中LOX（A)、HPL（B）及ADH（C）基因相對(duì)表達(dá)量的變化Fig. 6 Changes in relative expression levels of LOX (A), HPL (B) and ADH (C) genes in different kinds of tea leaves

不同葉態(tài)中脂肪代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)量如圖6所示。LOX1基因在搖青葉中相對(duì)表達(dá)水平最高，是鮮葉的9.62 倍，攤放葉中的表達(dá)水平其次，是鮮葉的4.44 倍。不同葉態(tài)的LOX1基因的表達(dá)量?jī)蓛芍g存在顯著性差異（P＜0.05）。LOX2和LOX3均是在攤放葉中表達(dá)水平最高，其次為搖青葉，攤放葉中LOX2、LOX3基因的表達(dá)水平分別是鮮葉的2.21 倍和5.97 倍，搖青葉中的表達(dá)水平則分別是鮮葉的1.39 倍和2.87 倍，不同葉態(tài)中LOX3基因兩兩間存在顯著性差異（P＜0.05），但LOX2基因僅攤放葉與鮮葉、搖青葉存在顯著性差異（P＜0.05），而鮮葉與搖青葉間并無顯著性差異。不同葉態(tài)中鮮葉的LOX4表達(dá)水平最高，其次為搖青葉，攤放葉中表達(dá)量最低。LOX4基因在搖青葉、攤放葉的表達(dá)量分別是鮮葉的94%和66%，同時(shí)不同葉態(tài)的LOX4基因的表達(dá)量?jī)蓛芍g也存在顯著性差異（P＜0.05）。不同葉態(tài)中的HPL基因以攤放葉表達(dá)水平最高，其次為搖青葉，攤放葉、搖青葉的HPL基因表達(dá)量分別是鮮葉的2.69 倍和1.68 倍，攤放葉中HPL基因表達(dá)水平與搖青葉、鮮葉間存在顯著性差異（P＜0.05），但搖青葉與鮮葉間不存在顯著性差異。不同葉態(tài)的ADH基因以搖青葉的表達(dá)量最高，其次為鮮葉，攤放葉最低，搖青葉、攤放葉的ADH基因表達(dá)水平分別是鮮葉的2.37 倍和1.01 倍，搖青葉中ADH基因與鮮葉、攤放葉間存在顯著性差異（P＜0.05），但攤放葉與鮮葉間不存在顯著性差異。

2.4 搖青機(jī)械力對(duì)愈傷酸含量的影響

圖7 不同葉態(tài)中愈傷酸的含量變化Fig. 7 Change in traumaic acid content in different kinds of tea leaves

除C6醛類物質(zhì)外，LOX/HPL系統(tǒng)的產(chǎn)物還有12-氧代-9(Z)-月桂烯酸，之后又會(huì)在十二?；鵆oA異構(gòu)酶（EC 5.3.3.8）的作用下最終形成反式-2-十二碳烯二酸，即愈傷酸。愈傷酸是天然存在于植物中的單元不飽和二羧酸，它能夠響應(yīng)植物的愈傷反應(yīng)，而介導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。通過LC-MS檢測(cè)不同葉態(tài)的愈傷酸含量，結(jié)果如圖7所示，愈傷酸含量：鮮葉＞攤放葉＞搖青葉，這說明在葉片失水過程中愈傷酸含量在減少，但搖青處理后愈傷酸的含量與鮮葉間的差異達(dá)顯著水平（P＜0.05），而攤放處理則未達(dá)到顯著水平。

2.5 搖青機(jī)械力作用下脂肪族類代謝物含量與相關(guān)基因表達(dá)量間的相關(guān)性分析

脂肪族類代謝物含量與脂肪族代謝途徑中LOX1-4、HPL及ADH基因的相關(guān)性分析如表2所示。結(jié)果表明，不同葉態(tài)中LOX1基因的表達(dá)水平與測(cè)得的脂肪族類香氣物質(zhì)含量均存在相關(guān)性，其中與青葉醛、正己醛含量極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與正己醇、反-3-己烯醇、反-4-己烯醇、丁酸葉醇酯、己酸葉醇酯、苯甲酸葉醇酯、異戊酸葉醇酯及丁酸己酯含量間均存在極顯著正相關(guān)性（P＜0.01），與反-2-己烯醇、乙酸葉醇酯間存在顯著性正相關(guān)性（P＜0.05）。ADH基因的表達(dá)水平與正己醇、反-3-己烯醇、反-4-己烯醇、乙酸葉醇酯、丁酸葉醇酯、己酸葉醇酯、苯甲酸葉醇酯、以及丁酸己酯間存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01），但與青葉醛、正己醛以及反-2-己烯醇之間不存在顯著相關(guān)性。LOX4基因的表達(dá)水平與正己醛、青葉醛含量存在顯著正相關(guān)性（P＜0.05），同時(shí)與反-2-己烯醇含量存在顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）。LOX3基因的表達(dá)水平與反-2己烯醇間存在顯著正相關(guān)性（P＜0.05），而LOX2和HPL基因表達(dá)量則與測(cè)得的所有脂肪族類香氣物質(zhì)含量均不存在顯著相關(guān)性。亞油酸、亞麻酸含量?jī)H與ADH基因表達(dá)量間存在顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），而愈傷酸含量與LOX1、LOX3基因表達(dá)量間存在極顯著負(fù)相關(guān)性（P＜0.01）。

表2 脂肪族類代謝物含量與脂肪酸代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coef fi cients between aliphatic aroma and relative expression levels of fatty acid metabolism-related genes

3 討 論

3.1 搖青機(jī)械力對(duì)脂肪族類代謝物的轉(zhuǎn)變

隨著鮮葉的離體，LOX/HPL系統(tǒng)開始氧化降解鮮葉中不飽和脂肪酸，搖青機(jī)械力進(jìn)一步加重離體葉的損傷程度，在搖青葉中C6醛類較攤放葉中轉(zhuǎn)化降低更為明顯，且亞油酸和亞麻酸含量均較低，這說明搖青機(jī)械力的刺激促進(jìn)了LOX/HPL系統(tǒng)的活性，Qian Xu等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄LOX/HPL代謝通路上相關(guān)基因的表達(dá)，能顯著促進(jìn)果實(shí)中綠葉揮發(fā)物質(zhì)（green leaf volatile，GLVs）的轉(zhuǎn)變。同時(shí)，這種損傷脅迫下促使了ADH基因表達(dá)水平的上調(diào)，并豐富了C6醇類及葉醇酯類衍生物，C6醇類在搖青葉中以正己醛和反式己烯醇為主，反式己烯醇的形成說明搖青機(jī)械力可能激活了異構(gòu)因子，C6醇類物質(zhì)由順式向反式轉(zhuǎn)變，這種異構(gòu)作用促使青葉中強(qiáng)烈的青氣香轉(zhuǎn)變?yōu)槿岷偷拟饲逑鉡34]，即完成低級(jí)的脂肪族類GLVs向果酯類香型轉(zhuǎn)變。葉醇酯類物質(zhì)是C6醇類物質(zhì)在AAT作用下葉醇類物質(zhì)的衍生物，配體的結(jié)合使化學(xué)性質(zhì)更加穩(wěn)定。測(cè)得的葉醇酯類及其衍生物普遍具備彌散性清新果香[35]，鮮葉和攤放葉中醇酯類物質(zhì)在組分和含量上都遠(yuǎn)低于搖青葉，這表明了搖青機(jī)械力可能激活了AAT的活性，促使酯化反應(yīng)發(fā)生。以失水為主的攤放葉受到的外界損傷較小，離體鮮葉中13-LOX亞族中的LOX2、LOX3基因及HPL基因大量表達(dá)，這說明酶系統(tǒng)在氧化裂解不飽和脂肪酸的同時(shí)，生成的愈傷酸可能響應(yīng)離體脅迫，而攤放過程中完成自我修復(fù)，從而抑制了LOX/HPL通路的下游酶活性。

3.2 LOX /HPL代謝通路基因的表達(dá)差異

LOX1基因在不同葉態(tài)中表達(dá)水平與所有脂肪族類香氣存在顯著相關(guān)性，LOX2、LOX3基因表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，這可能是因?yàn)槎咄瑢?3-LOX亞族，但LOX1、LOX4基因表達(dá)差異卻較大，尤其與C6醛類的相關(guān)性完全相反，造成這種現(xiàn)象的原因可能是13-LOX亞族基因核酸序列間相似度較高，而9-LOX亞族間基因相似度較低，這在一定程度上表明9-LOX亞族基因所編碼的蛋白在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了明顯的亞功能化，同時(shí)對(duì)茶樹中LOX1基因編碼的蛋白并非完全屬于9-LOX亞族[36]，該基因編碼的蛋白是一類具備雙裂解位點(diǎn)的9/13-LOX蛋白，Liu Shou’an等[37]驗(yàn)證茶樹中LOX1基因的性征，并發(fā)現(xiàn)在該基因在茶花衰老過程中表達(dá)水平明顯上調(diào)。Fu Xiumin等[38]研究了不同光質(zhì)條件下，LOX基因的表達(dá)模式。Gui Jiadong等[39]認(rèn)為烏龍茶的花果香與做青過程中青葉LOX活性上升有關(guān)。王晶[9]則研究了烏龍茶加工過程中LOX活性和香氣間的變化。這或許暗示著茶樹LOX基因家族中具備多裂解位點(diǎn)的家族成員，對(duì)茶葉加工過程中的香氣形成有著積極的影響。大量研究表明植物應(yīng)對(duì)外界損傷時(shí)LOX代謝途徑起主要作用的是13-LOX亞族的基因[40-42]，而LOX2、LOX3基因在攤放葉中應(yīng)對(duì)離體脅迫時(shí)候的大量表達(dá)正契合了這一觀點(diǎn)，同時(shí)也說明搖青機(jī)械力作用的二次損傷，雖不能上調(diào)13-LOX亞族基因的表達(dá)，但卻能顯著誘導(dǎo)上調(diào)9/13-LOX亞族中LOX1基因的表達(dá)。同時(shí)ADH基因的表達(dá)水平和葉醇酯類衍生物含量呈正相關(guān)，表明代謝途徑下游的ADH在機(jī)械力脅迫下對(duì)脂肪香氣的形成有積極的作用。辛肇軍等[28]從龍井43中克隆了CsADH1序列，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了CsADH1基因的表達(dá)受外界機(jī)械損傷、茉莉酸和水楊酸的誘導(dǎo)。

4 結(jié) 論

鮮葉中以亞麻酸和亞油酸為代表的不飽和脂肪酸，因采摘造成了第一次的損傷脅迫，激活了LOX/HPL系統(tǒng)，LOX與HPL將不飽和脂肪酸氧化降解為GLVs類物質(zhì)。搖青處理誘導(dǎo)了LOX1和ADH基因的轉(zhuǎn)錄，C6醛類物質(zhì)被還原為C6醇類物質(zhì)，在機(jī)械力反復(fù)作用的搖青葉中，二次損傷在間歇反復(fù)進(jìn)行，自身修復(fù)愈傷能力在做青后期已經(jīng)逐步散失，離體葉片中的愈傷酸不足以修復(fù)損傷，而這正激活下游的ADH、AAT，促使搖青葉中豐富的脂肪族類及其他香氣物質(zhì)的形成；但攤放過程中形成愈傷激素，失水的同時(shí)完成因采摘而形成第一次損傷的自我修復(fù)，并終止了下游代謝的進(jìn)行，所以，未經(jīng)搖青的綠茶以綠葉的清香為主，而搖青工藝則賦予了烏龍茶豐富的花果香（圖8）。

圖8 離體鮮葉脂肪酸代謝與綠茶、烏龍茶香氣形成的關(guān)系Fig. 8 Relationship between fatty acid metabolism in vitro in tea leaves and the aroma formation of green tea and oolong tea