蘇適，于德涵，柴寶麗，遲彩霞

(綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061)

黑豆為豆科植物大豆的干燥種子，味甘性平，含有不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物、纖維素、花青素、硒、磷、鐵多種微量元素和營養(yǎng)成分[1]。此外，黑豆還含有多種具有生理功效的物質(zhì)，如黑豆紅色素、多糖和皂苷等。其中花青素是黑豆色素的重要成分，具有較強的抗氧化能力，對機體代謝過程中產(chǎn)生多余的自由基，對增加血管彈性、延緩機體衰老等都有一定的作用[2,3]。黑豆比黃豆有更高的醫(yī)藥價值和開發(fā)前景，花青素屬于類黃酮類的化合物，黑豆皮色素含量高，是一種天然、安全、健康的食用色素。

目前，采用浸提法提取花青素的應(yīng)用較多，但此法溶劑用量大、耗時長、花青素得率較低[4]。超聲提取法在中草藥提取中應(yīng)用較多，利用超聲波的空化效應(yīng)和機械效應(yīng)，破壞植物組織細(xì)胞[5]，加強成分的溶出和擴散，將植物中的化學(xué)成分快速提取，提高產(chǎn)物的提取率，具有操作簡單方便、耗時短、不破壞有效成分、提取液雜質(zhì)少等特點。離子液體(ionic liquid)是在室溫下完全由離子組成的液體物質(zhì)[6]。離子液體能夠吸收超聲波，可用于超聲輔助提取的天然產(chǎn)物的溶劑，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、不易燃燒、使用中揮發(fā)性低、提取過程萃取能力好、可重復(fù)利用等特殊性質(zhì)[7-9]，同時可以通過超聲或升高溫度等方法提高有效成分的提取率，保持其高溶解性和萃取能力[10]。采用離子液體-超聲輔助提取黑豆中花青素的研究尚未見報道。因此，本文運用此方法，以黑豆皮為原材料提取花青素，資源廣泛，通過響應(yīng)面法得出最佳的提取工藝，同時研究黑豆皮花青素的抗氧化活性，為深入研究其應(yīng)用價值提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青仁黑豆，產(chǎn)地為黑龍江省。

原花青素標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；1-己基-3-甲基咪唑溴鹽(純度99%)：阿爾法試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

VGT-2013QT超聲波清洗器 廣州固特超聲儀器有限公司；XV-9200紫外分光光度計 北京市精密儀器廠；高速萬能粉碎機 北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

顯色劑組成A∶B為1∶1。

A為甲醇溶液將1.0000 g 香草醛定容于100 mL容量瓶中；B為甲醇溶液將8.00 mL 濃鹽酸定容于100 mL容量瓶中。

采用香草醛-鹽酸法測定黑豆皮原花青素的濃度。精密稱取10 mg原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精確量取0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL 容量瓶中，加入5.00 mL顯色劑，用1%的鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度線，搖勻，在 30 ℃恒溫水浴中恒溫 30 min，在530 nm波長處測定吸光度，以甲醇作為空白，以原花青素濃度(mg/mL)為X 軸，吸光度為 Y 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.9710X+0.0058，R2=0.9975。

1.3.2 黑豆皮花青素的提取

黑豆皮干燥到恒重，粉碎→ 過60目篩→ 準(zhǔn)確稱取1.0 g→加入離子液體乙醇溶液→超聲提取→離心30 min→測定上清液中花青素含量。

1.3.3 提取率計算

移取1.0 mL提取液，置于25 mL 容量瓶中，稀釋至刻度，在530 nm 處測定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取液中花青素濃度。

式中：C為花青素濃度(μg/mL)；V為定容體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)；M為黑豆皮質(zhì)量(g) 。

1.4 提取工藝優(yōu)化

準(zhǔn)確稱取黑豆皮1.0 g，采用離子液體-超聲輔助法提取黑豆花青素，考察離子液體濃度(0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mol/L)、超聲時間(15，25，35，45，55，65 min)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)、提取溫度(20，30，40，50，60，70 ℃)對黑豆花青素提取率的影響，在單因素試驗基礎(chǔ)上設(shè)計了四因素三水平試驗。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗，選取離子液體濃度(A)、提取時間(B)、料液比(C)、提取溫度(D)，以黑豆花青素收率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken Design中心組合設(shè)計原理，優(yōu)化黑豆花青素提取工藝，以花青素的提取率為響應(yīng)值，建立響應(yīng)回歸模型，因素水平見表1。

表 1 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 1 Design of response surface experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 離子液體濃度對提取率的影響

圖1 離子液體濃度對提取率的影響Fig.1 Effect of the concentration of ionic liquid on extraction yield

由圖1可知，隨離子液體[Bmim]Br 濃度的增加，花青素的提取率逐漸變大，當(dāng)[Bmim]Br 濃度為0.8 mol/L 時，花青素提取率達到最大值，但隨著離子液體濃度繼續(xù)增大，提取率逐漸下降。原因可能與提取溶劑的黏度相關(guān)，離子液體的濃度過高，提取液黏度也會增大，提取劑的擴散能力變差，難以滲到黑豆細(xì)胞的內(nèi)部，使得[Bmim]Br對黑豆花青素的溶出能力降低。因此，選擇離子液體[Bmim]Br 濃度為0.8 mol/L。

2.1.2 提取時間對提取率的影響

圖2 提取時間提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield

由圖2可知，隨提取時間的不斷增長，花青素提取率呈現(xiàn)增長趨勢，提取時間為45 min時，提取率達到最大值，但時間超過45 min，提取率開始降低。隨著提取時間繼續(xù)延長，通過超聲波空化作用和機械震動的持續(xù)作用，黑豆皮花青素向溶劑中逐漸溶出，提取率逐漸升高；但是提取時間過長導(dǎo)致細(xì)胞組織中大量細(xì)胞破裂，增加了其他雜質(zhì)的溶出；同時，提取時間過長會破壞花青素的結(jié)構(gòu)，從而使提取率下降。因此，提取時間選擇45 min。

2.1.3 料液比對提取率的影響

圖3 料液比對提取率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction yield

由圖3可知，隨著料液比的增長，花青素提取率逐漸增大，料液比為1∶50(g/mL)時，花青素提取率達到最大值，但料液比超過1∶50(g/mL)，花青素的提取率開始下降。原因可能是黑豆皮的質(zhì)量一定，提取劑的料液比過小，離子液體有一定的黏度，不利于花青素在溶劑中擴散，花青素向提取液轉(zhuǎn)移不完全；隨著料液比的增大，黑豆皮粉末在溶液中的分散程度增大，與提取液的接觸面積增大，有利于花青素的溶出；但大量溶劑會吸收一定的超聲波，降低了超聲波對細(xì)胞的破碎能力，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)花青素溶出減少，提取率下降；還可能因為乙醇和[Bmim]Br與花青素分子上的羥基之間存在氫鍵作用，隨著料液比的不斷增大，氫鍵作用逐漸增強，導(dǎo)致花青素的提取率降低。因此，料液比選擇1∶50(g/mL)。

2.1.4 提取溫度對提取率的影響

圖4 提取溫度對提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，花青素提取率逐漸增大，當(dāng)提取溫度為50 ℃時，提取率最大，但溫度繼續(xù)升高，提取率出現(xiàn)不斷降低的趨勢。原因可能是隨著體系的溫度升高，離子液體的運動速率和頻率也不斷變大，使其更容易滲透到黑豆皮組織細(xì)胞中，加速花青素的溶出，從而增加花青素的提取率。但繼續(xù)升高體系的溫度，過高的溫度會使花青素結(jié)構(gòu)上的酚羥基發(fā)生氧化，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)被破壞；也可能因為隨著溫度升高，細(xì)胞中其他內(nèi)容物溶出增多，導(dǎo)致溶液黏度增大，影響花青素向外溶出，從而使提取率下降。所以，選擇提取溫度50 ℃。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案Table 2 Design scheme of response surface test

續(xù) 表

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析，得到二次回歸擬合方程Y=4.21+0.084A+0.039B+0.080C-0.017D-0.025AB+2.750E-003AC-0.027AD-0.020BC+0.023BD-0.020CD-0.37A2-0.17B2-0.10C2-0.20D2。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

續(xù) 表

注：P>0.05為不顯著；P<0.05為顯著；P<0.01為極顯著。

對回歸方程進行顯著性檢驗，由表3可知，P<0.0001，說明數(shù)據(jù)模型方程達到極顯著水平；失擬值P=0.9972>0.05，無顯著差異，說明回歸方程與試驗擬合良好，誤差小。回歸方程各項方差分析表明，回歸模型一次項 A，B，C為模型極顯著因素，二次項 A2、B2、C2、D2為模型極顯著因素，其余各項對黑豆皮花青素得率影響均不顯著。因此，可用此模型對黑豆皮花青素提取工藝和提取率條件進行分析及預(yù)測。

2.2.2 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面圖可以顯著反映各因素之間相互作用的強弱，采用Box-Behnken 軟件對響應(yīng)曲面圖進行分析，可以得到各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，結(jié)果見圖5。如果響應(yīng)曲面較陡峭，說明該因素對花青素得率的影響較大，響應(yīng)值對于提取條件的改變就越敏感；如果響應(yīng)曲面相對平緩，說明該因素的波動對響應(yīng)值的影響較小。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface figures of the interaction of various factors

由圖5可知，離子液體濃度與提取溫度之間交互作用的響應(yīng)曲面最陡峭，對響應(yīng)值影響最顯著；離子液體濃度與提取時間之間交互作用的響應(yīng)曲面相對陡峭，說明對響應(yīng)值影響顯著程度次之；提取時間與提取溫度、提取時間與料液比、料液比與提取溫度、離子液體濃度與料液比的交互作用對提取率的影響顯著程度逐漸減小，表現(xiàn)為曲線較為平滑，響應(yīng)值無顯著性變化。可知影響黑豆皮花青素提取率的各交互作用因素順序為AD>AB>BD>BC>CD>AC。

2.2.3 驗證試驗

結(jié)合單因素試驗，分析回歸模型，經(jīng)過驗證，最終得出該提取方法準(zhǔn)確可靠、可行。黑豆皮花青素的最佳提取條件：離子液體濃度0.93 mol/L，提取時間45.39 min，料液比1∶50.96，提取溫度43.94 ℃，理論預(yù)測值4.1291 mg/g。結(jié)合實驗實際情況，最終選擇離子液體濃度0.9 mol/L，提取時間45 min，料液比1∶51，提取溫度44 ℃，進行5次平行試驗，得到花青素提取率平均值為4.118 mg/g，與預(yù)測值接近，驗證了此模型的有效性，說明預(yù)測模型與實際情況擬合較好。

2.3 與傳統(tǒng)提取法的比較試驗

為了對比傳統(tǒng)提取方法和離子液體對黑豆皮的提取效果差異，分別采用乙醇加熱回流法、乙醇超聲輔助提取法和[Bmim]Br的離子液體超聲輔助提取法在優(yōu)化的條件下對花青素進行超聲波輔助提取。由表4可知，離子液體超聲輔助法提取黑豆花青素的提取率均高于普通溶劑。離子液體對天然成分提取的優(yōu)勢是由于有機陰離子對植物纖維素有極強的溶解性，能極大破壞植物細(xì)胞壁，并通過氫鍵、色散力、范德華力等方式結(jié)合活性成分，使天然成分更容易溶出。在超聲波輔助作用下，超聲的空化效應(yīng)能加速離子液體穿透植物組織，促進植物組織內(nèi)的黑豆花青素溶出，同時[Bmim]Br可能作為一種載體將黑豆花青素從植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運出來，從而提高了黑豆花青素得率。

表4 離子液體與傳統(tǒng)溶劑的比較Table 4 Comparison of ionic liquid with traditional solvent

3 離子液體的回收

由于[Bmim]Br離子液體的密度大，沸點高，提取后的離子液體中加入與其不互溶的乙酸乙酯來分離花青素，分離出與乙酸乙酯不互溶的離子液體，再減壓蒸餾蒸除水分，再在真空烘干箱中65 ℃烘干，對分離出的離子液體進行吸光度測定，回收的離子液體吸光度值與未使用過的離子液體吸光度值接近。采用回收的[Bmim]Br離子液體進行重復(fù)提取，進行 3 次平行試驗，提取率達到首次提取率的92.55%，因此，可再重復(fù)利用進行提取。

4 結(jié)論

本研究采用離子液體-超聲輔助提取法，對黑豆皮花青素的提取工藝進行了研究。根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，得到最佳工藝條件為：離子液體濃度0.9 mol/L、料液比 1∶51(g/mL)、提取溫度44 ℃、超聲時間 45 min，進行5次平行試驗；在此條件下黑豆皮花青素的提取率可達4.118 mg/g。離子液體的極性可控，可以對中藥中的復(fù)雜成分進行選擇性提取，與傳統(tǒng)提取工藝相比，該提取工藝時間短，所需溶劑少，離子液體可重復(fù)利用。本文采用離子液體超聲輔助提取黑豆皮中花青素，獲得較優(yōu)提取工藝參數(shù)，可為深層次開發(fā)天然色素的研究提供理論依據(jù)，有益于黑豆皮花青素在食品工業(yè)上的推廣與應(yīng)用。