高玉斌,趙 格,鄒 明,李月華,趙建梅,劉 坤,蓋文艷,王君瑋

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,山東 青島 266109;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(青島),山東 青島 266032)

大腸桿菌為人和動物腸道中存在的共棲菌之一,絕大多數(shù)為人類和溫血動物腸道中的正常菌群。部分大腸桿菌具有致病性,其中致瀉性大腸桿菌根據(jù)血清型別、毒力因子和所致癥狀不同又可分為5種類型：腸致病性大腸桿菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC)、腸侵襲型大腸桿菌(Enteroinvasive E.coli,EIEC)、腸凝聚型大腸桿菌(Enteroaggregative E.coli,EAEC)、腸毒素型大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)和腸出血型大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC)[1]。致病性大腸桿菌中有些菌株能引起雞群發(fā)病,導(dǎo)致氣囊炎、肝周炎、心包炎或敗血癥相關(guān)綜合征,給養(yǎng)殖業(yè)帶來持續(xù)性經(jīng)濟損失。大腸桿菌具有許多毒力因子,其中一些與大腸桿菌致病性有關(guān)。ompT是革蘭陰性菌表面一種特殊的蛋白。fimC是I型菌毛的重要部分,I型菌毛是雞源致病性大腸桿菌的重要毒力因子。stx是產(chǎn)致賀菌毒素大腸桿菌重要的毒力因子。iss基因位于大腸桿菌的ColV質(zhì)粒上,與細菌抗補體作用有關(guān)。iutA是氣桿菌素的基因之一,被認為是鑒定致病性大腸桿菌的遺傳標記。

為了解我國禽源大腸桿菌的致病性和耐藥狀況分布,對2017年從山東、西藏、云南等7個代表性地區(qū)分離獲得的發(fā)病雞源大腸桿菌進行了致病類型、毒力因子攜帶及耐藥表型分析,以比較不同家禽養(yǎng)殖地區(qū)雞群發(fā)病后分離獲得的大腸桿菌的致病性差異和耐藥狀況,為家禽養(yǎng)殖過程中大腸桿菌病的防治、用藥和禽肉蛋產(chǎn)品消費中的大腸桿菌污染風險管控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2017年從我國7個省(自治區(qū))的部分發(fā)病雞場病死雞泄殖腔拭子中分離鑒定的大腸桿菌,共130株。其中,吉林20株,山東28株,山西30株,西藏18株,新疆7株,江蘇15株,云南12株。上述菌株均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心動物產(chǎn)品安全監(jiān)測室保存。大腸桿菌標準菌株(ATCC 25922),購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑 Master Mix為美國Promega公司產(chǎn)品;瓊脂糖為西班牙Biowest公司產(chǎn)品;Marker-2000,購自寶生物工程(大連)有限公司;三糖鐵瓊脂,購自北京陸橋生物技術(shù)有限責任公司;BIOFOSUN?革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板,購自上海星陌生物技術(shù)有限公司;五種致病性大腸桿菌多重PCR鑒定試劑盒,由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(青島)提供。毒力因子PCR引物由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 致病性大腸桿菌的鑒定參照試劑盒說明書進行。 檢測的靶基因為eae、stx、est、elt、ipaH、aggR。

1.4 毒力基因檢測引物 參考Timothy Johnson等[4]報道的引物序列,選擇合成7對用來檢測禽源致瀉性大腸桿菌的毒力基因引物,分別為iutA、hlyF、iss、iroN、ompT、stx2 和fimC。

1.5 藥敏試驗 采用微量肉湯稀釋法測定15種抗菌藥物對分離菌株的最小抑菌濃度(MIC)。參照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)標準進行結(jié)果判定和質(zhì)量控制。

15種抗菌藥分別是：青霉素類：氨芐西林(AMP)、奧格門丁(A/C)、美羅培南(MEM);頭孢類：頭孢噻呋(CEF)、頭孢他啶(CAZ);氨基糖苷類：慶大霉素(GEM)、大觀霉素(SPT);四環(huán)素類：四環(huán)素(TET)、多西環(huán)素(DOX);酰胺醇類：氟苯尼考(FFC);磺胺類：復(fù)方新諾明(SXT)、磺胺異噁唑(SF);氟喹諾酮類：恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL);其他：粘桿菌素(CL)。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌致病類型 130株雞源大腸桿菌參照試劑盒說明書進行檢測,5株為致病性大腸桿菌,且均為ETEC類型,占全部分離菌株的3.85%(5/130)。其中,來自山西1株(3.33%,1/30)、山東4株(14.29%,4/28)。PCR擴增結(jié)果見圖1。

圖1 多重PCR鑒定不同致病類型圖

2.2 毒力因子檢測結(jié)果 分離菌株經(jīng)復(fù)蘇后,進行ompT、stx2、iss、fimC、iroN、hlyF、iutA7 種毒力基因的PCR檢測。來自7個省份的大腸桿菌分離株中,7種毒力基因均有不同程度的檢出(見表1),但不同省份分離菌株毒力基因攜帶種類和比例有較大差異。

7種毒力基因中,iroN基因檢出率最高(69.23%,90/130),stx2基因檢出率最低(1.54%,2/130)。不同區(qū)域菌株中攜帶的毒力因子種類分布見圖2。西藏菌株中只檢測出ompT和iroN兩種基因,檢出率分別為11.11%(2/18)、16.67%(3/18);stx2基因僅在山東菌株中檢出,攜帶比例為7.14%(2/28);iroN基因在山東和新疆分離株中的檢出率均為100%,除西藏分離株比例較低外,來自吉林、山西、云南、江蘇的分離株中iroN基因的攜帶率均在55%～60%之間。

表1 不同區(qū)域大腸桿菌分離株中毒力因子檢出情況 /%

圖2 不同地區(qū)各毒力因子檢出數(shù)量及分布

對單株分離菌株的毒力因子攜帶情況分析表明,含有5種和6種毒力因子的菌株數(shù)量最多,分別為 20.77%(27/130)、20%(26/130)。有15.38%(20/130)的菌株不含所測7種毒力因子,未發(fā)現(xiàn)同時含有7種毒力因子的分離菌株。不同分離菌株中攜帶毒力因子的比例見圖3。

圖3 130個分離株中攜帶不同毒力因子數(shù)量的菌株比例分布

2.3 藥敏試驗結(jié)果 通過對130株雞源大腸桿菌進行藥敏檢測,結(jié)果表明：菌株對TET耐藥率最高(91.54%,119/130),其次是 AMP(90.77%,118/130),對MEM的耐藥率最低(12.31%,16/130)。來自不同區(qū)域的大腸桿菌分離株對15種藥物的耐藥檢測結(jié)果見表2。

表2 不同地區(qū)分離菌株的耐藥率比較 /%

從分離菌株來源的不同地區(qū)看,西藏菌株除對CL耐藥率高達95%外,對其他藥物的耐藥率水平均較低,特別是對GEM和MEM沒有耐藥性;新疆菌株耐藥率相對較高,除A/C和CL外,對其他藥物的耐藥率均在78%以上;云南菌株雖然對MEM沒有耐藥性,但對 AMP、TET、SPT、SF、SXT、FFC、ENR和OFL的耐藥率均達到100%。從菌株對不同藥物的耐藥率看,對AMP的耐藥率總體較高,除了西藏菌株外,來自其他6省的分離菌株耐藥率都在90%以上。不同地區(qū)分離株對TET的耐藥率均在70%以上。分離菌株對CL和MEM的耐藥率相對較低,其中CL除了對來自西藏和云南的菌株耐藥較高外,其他均在30%以下;MEM除了新疆菌株外,其他地區(qū)菌株最高耐藥率僅為16.67%,而來自山西、西藏、云南和江蘇的菌株對其均沒有耐藥性。

多重耐藥情況結(jié)果顯示：雞源大腸桿菌的多重耐藥和交叉耐藥情況比較嚴重,94.62%(123/130)的分離菌株對3種或3種以上的藥物耐藥,其中最多耐藥達到15種藥物。耐6～8種藥物的分離菌株占83.85%(109/130),菌株多重耐藥分布比較見圖4。

圖4 菌株耐藥分布情況

3 討論

雞源大腸桿菌中多數(shù)為腸道中的正常菌群,但部分大腸桿菌具有致病性,可引起雞群發(fā)病,導(dǎo)致氣囊炎、肝周炎、心包炎或敗血癥相關(guān)綜合征,給養(yǎng)殖業(yè)帶來持續(xù)性經(jīng)濟損失。有的菌株還可引起人類胃腸炎、泌尿系統(tǒng)感染和腦膜炎等疾患,嚴重影響公共衛(wèi)生安全。因此,了解致病性大腸桿菌在我國不同地區(qū)的分布情況及其耐藥性差異,對合理選擇藥物、制定有效防治措施具有重要指導(dǎo)作用。從對2017年分離自山東、云南、西藏等7個不同省份的菌株分析情況看,在致病性方面,只有山東、山西鑒定出ETEC,其他省份均沒有檢測出致病性大腸桿菌,致病性大腸桿菌檢出率僅為 3.8%,與LeStrange等[5]所研究的菌株檢出率3.6%差異不顯著。我國發(fā)病雞源大腸桿菌在致病性方面存在較大的地區(qū)性差異。

本研究發(fā)現(xiàn),在跨度較大的7個省份中,只有來自山東的2個分離菌株攜帶stx2基因,檢出率很低,該毒力因子的分布是否與其傳播速度的緩慢有關(guān)有待于進一步研究。此外,西藏地區(qū)分離株檢出的毒力因子的種類及數(shù)量相較于其他地區(qū)分離株均較低,分析可能與西藏地區(qū)地處青藏高原,養(yǎng)殖密度較低,菌株進化慢有關(guān)。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),攜帶ompT毒力因子的菌株比例(39.23%)與Mohamed等[6]的報道的比例(86.9%)差異比較顯著,攜帶iutA基因的菌株比例(61.54%)與2014年劉紅玉等[7]的報道(67.47%)差異不顯著。目前致病性大腸桿菌攜帶有較多的毒力因子,可能與其毒力或者血清型存在一定的關(guān)系,需進一步研究。

大腸桿菌病作為獸醫(yī)臨床的常發(fā)病,臨床上一般首選抗菌藥物進行治療,但長期大量的盲目使用抗菌藥物會導(dǎo)致大腸桿菌菌株的耐藥率升高[8]。本研究發(fā)現(xiàn),菌株對CL、MEM的耐藥率較低,這與Rahmatallah[9]研究的菌株對CL的耐藥率2%要高,說明國內(nèi)對CL仍然存在不合理用藥的情況。藥敏試驗結(jié)果表明,菌株對AMP與TET耐藥率最高,分別是90.77%、91.54%,這與Halfaoui等報道[10]菌株對TET(94.12%)、AMP(83.01%)的耐藥率差異不顯著,菌株耐藥水平都較高,這可能是因為AMP、TET在臨床上的使用時間長有關(guān)。西藏地區(qū)菌株耐藥率較低,可能是由于西藏養(yǎng)殖密度低,藥物使用量少、頻率低有關(guān)。本試驗中多重耐藥菌株占94.62%,6～8重占主導(dǎo),這與 Rahmatallah[9]所報道的菌株對多重耐藥菌株占97.4%,3重、5重占主導(dǎo)差異顯著,由此表明,00不同地區(qū)分離菌株對相同的藥物耐藥率存在明顯的差異,這可能與當?shù)嘏R床用藥情況相關(guān)。隨著多重耐藥的增加,聯(lián)合用藥的效果也必然越來越差。