戴愛玲,劉建奎,王德永,魏春華,林日丹,楊小燕

(1.龍巖學院生命科學學院,福建 龍巖 364000;2.福建省生豬疫病防控工程技術研究中心,福建 龍巖 364000)

豬瘟(Classic Swine Fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classic Swine Fever virus,CSFV)引起的一種高度接觸傳染病,發(fā)病率高,死亡率高,嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展[1-3]]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類傳染病,我國定為Ⅰ類烈性傳染病。我國自20世紀50年代成功研制豬瘟兔化弱毒疫苗(C株或HCLV)以來,豬瘟的流行得到有效控制,但是在長期免疫壓力下,豬瘟病毒出現(xiàn)一定程度變異,臨床表現(xiàn)日趨復雜[2],溫和型和非典型豬瘟的廣泛流行給豬瘟的臨床診斷與防控提出挑戰(zhàn),因此及早檢測被感染豬群,對于豬瘟的防控具有重要的意義。臍帶血是母豬分娩后,仔豬斷臍時殘留在臍帶中的血液,由于豬胎盤特性,絕大部分免疫球蛋白都無法通過胎盤屏障,但某些疫病能通過胎盤屏障感染仔豬。因此,臍帶血檢測對豬疫病早期預警及防控具有較高臨床應用價值[4][。

豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2是病毒識別和吸附宿主細胞的病毒結(jié)構(gòu)蛋白,在CSFV增殖過程中具有重要作用,同時E2蛋白能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體,E2結(jié)構(gòu)蛋白抗原變異與免疫逃逸有關,是導致豬場CSFV持續(xù)感染的主要原因之一[5]。福建省某存欄母豬550頭的規(guī)模化豬場,母豬豬瘟疫苗采取一年普免3次的免疫方式,ST傳代細胞活疫苗2.5頭份/頭。該豬場哺乳仔豬出現(xiàn)個別弱仔、拉稀現(xiàn)象,發(fā)病仔豬經(jīng)實驗室檢測為豬瘟病原陽性。為了明確哺乳仔豬的發(fā)病是否與CSFV經(jīng)胎盤垂直感染有關,本試驗連續(xù)收集分娩母豬的臍帶血,應用熒光定量PCR檢測臍帶血CSFV,RT-PCR方法對陽性樣品進行擴增、克隆以及CSFV E2基因測序,分析豬瘟病原遺傳變異情況。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 臍帶血收集于福建省某存欄母豬550頭的規(guī)?；i場,每頭分娩母豬至少采集5頭以上初生且未吃初乳的仔豬,每頭仔豬采集2 mL,混合后-20℃保存,標明采集日期和對應母豬的耳號,共計采集117份臍帶血。

1.2 主要試劑 M-MuL反轉(zhuǎn)錄酶、RAN酶抑制劑、Taq DNA聚合酶,購自寶生物工程(大連)有限公司;RNA提取試劑盒百泰克生物技術北京有限公司;凝膠回收試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑盒,購自北京尚儀有限公司。

1.3 引物設計與合成 參考文獻[6]設計合成1對特異性引物用于CSFV E2基因的擴增,擴增片段大小約為272 bp,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 CSFV E2基因引物序列

1.4 熒光定量PCR檢測 取250 μL臍帶血,按照RAN提取試劑盒方法提取病毒基因組RNA,參照豬瘟熒光定量RT-PCR試劑盒說明書進行熒光PCR檢測。

1.5 RT-PCR鑒定 通過RT-PCR方法對熒光定量RT-PCR檢測為陽性的樣品進行CSFV E2基因擴增。應用反轉(zhuǎn)錄M-MμL酶將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進行RT-PCR擴增。PCR 的反應體系 25μL：10 × Buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mmol/L)2 μL。 模板 cDNA 2 μL,上下引物各1 μL(10 pmol/mL),Taq酶(5u/μL)0.2 μL,用DEPC水補齊25 μL。PCR擴增程序：96℃ 3 min;95℃ 45 s,56.2℃ 45 s,72℃ 45 s,35個循環(huán);72℃ 10 min,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 目的基因克隆與序列分析 目的片段經(jīng)膠回收后連接到pMD19-T載體上,將鑒定均為陽性的重組菌株送往北京睿博興科生物技術有限公司測序。采用DNAStar軟件對CSFV E2基因進行核苷酸序列和氨基酸序列同源性比對及分析,同時繪制出遺傳系統(tǒng)發(fā)生樹。本研究所用的國內(nèi)外參考毒株見表2。

表2 CSFV E2基因參考株

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR檢測結(jié)果 采用熒光定量RTPCR方法對117份臍帶血進行檢測,結(jié)果表明,CSFV感染率為7.69%(9/117),部分熒光定量PCR結(jié)果如圖1所示。

圖1 部分樣品CSFV E2基因熒光定量PCR結(jié)果

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果 應用RT-PCR對9份陽性樣品進行CSFV E2擴增,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,均在約270 bp處出現(xiàn)擴增條帶,大小與預期結(jié)果相符(圖2)。

圖2 CSFV E2基因片段的RT-PCR擴增結(jié)果

2.3 目的基因序列測定及分析

2.3.1 核苷酸序列同源性分析 將5株CSFV E2基因(編號 1 ～ 5,樣品號：2253、3137、2639、3573、3733)與20株CSFV參考毒株(表2)核苷酸序列進行比對,結(jié)果表明,5株CSFV E2基因之間的同源性為97.8%～100%,與參考株之間的同源性為80.0% ～97.5%,與94.4-IL-94-TWN株同源性最低為80.0%,與C株和HCLV株的同源性分別為95.6% ～96.7%、96.4% ～97.5%,與 Shimen株的同源性為92.7%～94.5%。

2.3.2 氨基酸同源性序列分析 將5株CSFV E2基因(編號1～5)推導的氨基酸序列與20株CSFV參考毒株(表2)序列進行比對。結(jié)果顯示,5株毒株E2基因之間的氨基酸同源性為97.8%～100%,與參考株之間同源性為83.5% ～96.7%,與C株和HCLV株同源性為95.5% ～96.7%,與經(jīng)典強毒株Shimen株的同源性為94.4% ～95.6%,與P97株基因型為3.4同源性最低為83.5%。

2.4 遺傳進化樹分析 為了進一步研究5株CSFV遺傳特征,利用DNAStar軟件對CSFV E2基因進行了比對和分析。結(jié)果表明,5個毒株均處于1.1亞群,與C株和HCLV株親緣關系最近(圖5)。

2.5 氨基酸序列分析 對5株CSFV E2基因推導的氨基酸位點和疫苗HCLV株E2基因氨基酸位點進行比對分析,結(jié)果顯示,與HCLV相比,5株CSFV E2基因推導的氨基酸序列均存在D5→N、R88→G88和S89→F89的突變。此外,3137株在存在S3→T3的變異,3573株存在在15位點氨基酸T15→I15的變異,這些氨基酸位點變異可能導致分離株抗原發(fā)生變化(圖6)。

圖3 CSFV E2基因的核苷酸同源性分析

圖4 CSFV E2基因的氨基酸同源性分析

圖5 CSFV E2基因核苷酸的遺傳進化樹

圖6 5株CSFV E2基因與疫苗株HCLV E2基因推導氨基酸序列比對

3 討論

豬瘟病毒在世界范圍廣泛流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。豬瘟病毒只有一個血清型,但是不同毒株之間的毒力差異較大,導致其流行形式發(fā)生變化,現(xiàn)臨床上以溫和型和非典型豬瘟為主,豬瘟帶毒豬無明顯臨床癥狀,帶毒妊娠母豬不僅造成繁殖障礙還會垂直感染仔豬,同時持續(xù)排毒的特點影響整個豬群的健康,所以對妊娠母豬豬瘟病原監(jiān)測與病原特性分析對豬瘟防控顯得尤為重要。已有應用臍帶血檢測技術在防控產(chǎn)房仔豬腹瀉[4]、評估生產(chǎn)母豬重要病原感染狀況的報道[7]。臍帶血與血樣和組織樣品比較,獲取方便、不會對豬群產(chǎn)生應激更具優(yōu)勢。因此,采用臍帶血進行病原檢測具有更好的臨床應用價值。

本試驗應用熒光定量PCR對117份臍帶血進行檢測,豬瘟病原陽性率為7.69%。根據(jù)9份陽性樣品編號對應的母豬進行臨床追溯調(diào)查,結(jié)果9頭母豬中有6胎次及以上的母豬占55.6%(5/9)5頭,3胎以下比例33.3%(3/9),平均產(chǎn)仔數(shù)8.3頭,活仔率84.8%,窩產(chǎn)仔數(shù)低于7頭的母豬有3頭,早產(chǎn)母豬2頭。表明該場臍帶血豬瘟病原陽性的母豬生產(chǎn)性能較差,低于豬場母豬平均生產(chǎn)性能(平均總產(chǎn)仔為10.6頭,平均活仔豬數(shù)為9.9頭,總仔活率為93.5%)。由此可見,母豬豬瘟病毒帶毒是引起母豬生產(chǎn)性能較低的主要因素之一。

CSFV E2基因是公認遺傳分型靶標段,也是抗原變異核心區(qū)域,從分子水平對CSFV流行毒株進行遺傳分型可以追蹤病毒的來源[8]。研究表明,對CSFV E2基因進行核苷酸序列及遺傳進化分析能在一定程度上能夠揭示病毒變異情況。通過對5株CSFV E2基因擴增、克隆、測序,并與國內(nèi)外毒株進行基因序列比較,5株CSFV E2基因之間核苷酸同源性均為97.8% ～100%,與C株和HCLV株同源性分別為95.6% ～96.7%、96.4% ～97.5%,與Shimen株的同源性為92.7% ～94.5%;氨基酸同源分析表明,5株CSFV E2基因推導的氨基酸之間同源性為97.8% ～100%,但是與疫苗株HCLV同源性為95.5%～96.7%,氨基酸變異位點分析表明其基因序列發(fā)生了較小程度的變異,與疫苗株HCLV相比較,均在 aa 5(D→N)、aa 88(R→G)、aa 89(S→F)位點發(fā)生突變,其中3 137株第3位氨基酸S突變成T,3573株在15位點氨基酸T變成I。遺傳進化樹表明,分離毒株與C株和疫苗株HCLV親緣關系較近,且都處于1.1亞群。王琴等[9-10]通過對我國1985-2011年豬瘟病毒分子流行病學調(diào)查表明,我國豬瘟病毒具有遺傳多樣性,大部分地區(qū)流行的豬瘟病毒依然是基因2.1亞群和1.1亞群為主。本課題組對福建地區(qū)2013-2014年31株豬瘟病毒E2基因分型表明,福建地區(qū)以基因2.1亞群和1.1亞群為主,處于1.1亞群的23分離株與HCLV株親緣關系較近[11]。2014-2015年李棟梁報道了河南省1株1.1亞群的CSFV E2與HCLV株親緣關系較近[12]。SHEN等在研究中國華南地區(qū)豬瘟病毒E2基因時,與經(jīng)典毒株(HCLV)比較,發(fā)現(xiàn)了4個氨基酸位點突變,表明處于1.1亞群且與HCLV株親緣關系較近的毒株可能是弱毒株[13-14]。

綜上所述,該豬場通過胎盤屏障感染仔豬的豬瘟病毒可能來源于疫苗株,這種現(xiàn)象應該引起重視。