余蕙君，劉青，崔勝金，曹朝鵬，周義文

(南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院,廣東深圳518110)

結直腸癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來隨著人民飲食結構和飲食習慣改變以及人口老齡化加劇，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1，2]。目前，結直腸癌的治療已取得了巨大進步，如微創(chuàng)手術普及、新型化療藥物和分子靶向藥物臨床應用，明顯提高了治療效果[3]。但對于中晚期結直腸癌患者，失去了手術根治的機會，內科治療效果亦不理想，患者預后往往較差。因此，有必要深入研究結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找更可靠的腫瘤標志物用于疾病篩查以及指導臨床治療[4]。隨著RNA檢測技術的發(fā)展，在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了多種非編碼RNA(ncRNA)異常表達，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。微小RNA(miRNA)是一類內源性非編碼小分子RNA，長度為18～25個核苷酸，通過結合mRNA的3′非編碼區(qū)，改變mRNA的穩(wěn)定性，影響靶基因表達，不僅可參與正常細胞的增殖、分化、凋亡等調控過程，還可參與腫瘤細胞的惡性增殖、浸潤和遷移等[5]。miR-181a是miRNA家族成員之一，屬于miR-181家族，定位于人5號染色體上。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a可調節(jié)下游抑癌基因PTEN表達，影響下游細胞信號傳導，從而促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移等[6]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸、具有多種調控功能的RNA分子，可作為分子海綿結合miRNA或染色質修飾因子，調節(jié)靶基因表達。lncRNA結直腸腫瘤差異表達基因(CRNDE)是結直腸腫瘤差異表達基因的表達產物，定位于人16號染色體上，可在多種惡性腫瘤組織中異常表達[7]。本研究觀察了結直腸癌組織lncRNA CRNDE、miR-181a表達變化，并探討二者在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年4月～2018年10月南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院收治的結直腸癌患者91例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合結直腸癌診斷，病理類型為腺癌；②初診，年齡24～78歲；③行結直腸癌切除手術，術前未接受任何抗腫瘤治療；④Karnofsky評分≥60分，預計生存期≥3個月；⑤臨床病理資料完整。排除標準：①合并結直腸其他疾病、其他部位惡性腫瘤以及心、肝、肺、腎等重要臟器嚴重疾病者；②術前已接受任何抗腫瘤治療者；③臨床病理資料不完整者。其中，男56例、女35例，年齡(54.1±8.7)歲；腫瘤類型：結腸癌52例，直腸癌39例；腫瘤直徑：<5 cm 41例，≥5 cm 50例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期44例，Ⅲ、Ⅳ期47例；組織分化程度：高中分化61例，低分化30例；有淋巴結轉移19例，無淋巴結轉移72例。本研究經南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA CRNDE、miR-181a表達檢測 采用RT-qPCR法。將手術切除的結直腸癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣≥5 cm)置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。實驗前取凍存組織20～30 mg，液氮下研磨成粉末，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實驗。按反轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA，逆轉錄反應條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。以cDNA為模板，按RT-qPCR試劑盒說明進行PCR擴增。所有引物序列由深圳華大基因股份有限公司設計合成。lncRNA CRNDE上游引物5′-GCGGAGGAGAGGTGTTAAGTGT-3′，下游引物5′-AACAGGTTTTACCTCCTTATCTTCAGAA-3′；內參GAPDH上游引物5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。miR-181a上游引物5′-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3′，下游引物5′-UUGUACUACACAAAAGUCUG-3′；內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′。lncRNA CRNDE PCR反應體系共20 μL：cDNA模板2 μL，上下游引物各0.8 μL，2×SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，50×ROX Dye 0.4 μL，無菌水6 μL；反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s、54 ℃ 35 s、72 ℃ 30 s共40個循環(huán)。miR-181a PCR反應體系共40 μL：cDNA模板2.6 μL，上下游引物各0.8 μL，TaqMan Universal PCR Master MixⅡ 20 μL，small RNA Assay 2 μL，無菌水補足至40 μL；反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環(huán)。所有反應在ABI 7900型實時熒光定量PCR儀上完成。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 結直腸癌組織與癌旁正常組織lncRNA CRNDE、miR-181a表達比較 結直腸癌組織與癌旁正常組織lncRNA CRNDE相對表達量分別為0.896±0.120、0.124±0.057，miR-181a相對表達量分別為0.326±0.072、2.307±0.259。結直腸癌組織lncRNA CRNDE相對表達量明顯高于癌旁正常組織，miR-181a相對表達量明顯低于癌旁正常組織(t分別為55.434、70.298，P均<0.05)。

2.2 結直腸癌組織lncRNA CRNDE、miR-181a表達與患者臨床病理特征的關系 結直腸癌組織lncRNA CRNDE、miR-181a表達與腫瘤臨床分期、組織分化程度有關(P均<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤類型、腫瘤直徑和淋巴結轉移無關(P均>0.05)。見表1。

表1 結直腸癌組織lncRNA CRNDE、miR-181a表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 結直腸癌組織lncRNA CRNDE表達與miR-181a表達的關系 結直腸癌組織lncRNA CRNDE相對表達量與miR-181a相對表達量呈明顯負相關關系(r=-0.632，P<0.05)。見圖1。

圖1 結直腸癌組織lncRNA CRNDE表達與miR-181a表達的關系

3 討論

結直腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，每年導致近70萬人死亡，是世界上僅次于肺癌、肝癌和胃癌的第四大致命癌癥。近年來隨著人民飲食結構和飲食習慣改變以及人口老齡化加劇，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[8]。結直腸癌的病因與遺傳因素、環(huán)境因素、飲食習慣等有關，但其確切發(fā)病機制尚不清楚。目前認為，結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟參與的復雜過程[9]。因此，深入研究結直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，對疾病早期篩查和指導臨床治療具有重要意義。

近年隨著RNA檢測技術的發(fā)展，在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了多種ncRNA異常表達，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，ncRNA通過調控靶基因參與相關信號轉導通路，繼而影響腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移及血管生成等過程[10]?；诤塑账衢L度，可將ncRNA分為短ncRNA(<200 nt)和長ncRNA(>200 nt)。miRNA是一類短ncRNA，可通過直接抑制mRNA翻譯或通過結合其3′非翻譯區(qū)降解mRNA分子，在轉錄后水平調控靶基因表達，從而參與細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程。miR-181a是miRNA家族成員之一，屬于miR-181家族，定位于人5號染色體上。miR-181a在乳腺癌、非小細胞肺癌、膠質瘤等組織中異常表達，可通過影響STAT3、MET等基因表達，參與腫瘤的惡性進展[11～13]。在結腸癌細胞中，miR-181a能夠通過影響PRKCD基因表達，發(fā)揮調控腫瘤細胞生長作用[14]。lncRNA是一類長ncRNA，可作為分子海綿結合miRNA，參與神經元的分化發(fā)育、配子形成及腫瘤進展等過程。lncRNA CRNDE是結直腸腫瘤差異表達基因的表達產物，定位于人16號染色體，與IRX5基因相鄰，可與IRX5共享雙向啟動子。lncRNA CRNDE具有組織特異性和時間特異性表達模式，在人體正常組織中幾乎不表達，但在腫瘤組織中表達明顯升高，有可能成為腫瘤早期診斷的指標和潛在的治療靶點。但目前關于結直腸癌組織lncRNA CRNDE、miR-181a表達變化及二者表達關系的報道較少。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織miR-181a相對表達量明顯低于癌旁正常組織，與以往報道[6]基本一致。其具體原因尚不清楚，可能與miR-181a的雜合性缺失有關，也可能與miR-181a表觀遺傳學修飾后導致其功能失活有關。本研究結果還發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織miR-181a表達與腫瘤臨床分期、組織分化程度有關，而與患者性別、年齡、腫瘤類型、腫瘤直徑和淋巴結轉移無關。表明miR-181a可參與結直腸癌的惡性進展。本研究結直腸癌組織lncRNA CRNDE相對表達量明顯高于癌旁正常組織。其具體原因亦不清楚，可能是抑制lncRNA CRNDE表達的miRNA，如miR-384表達下調，導致lncRNA CRNDE mRNA穩(wěn)定性增加，進而引起lncRNA CRNDE轉錄后表達上調[15]。本研究結果還顯示，結直腸癌組織lncRNA CRNDE表達與腫瘤臨床分期、組織分化程度有關。表明lncRNA CRNDE亦參與結直腸癌的惡性進展。

有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CCAT1可作為分子海綿結合miR-181a，進而影響下游靶基因HOXA1表達，從而促進腫瘤細胞增殖和遷移[16]；高度保守的異質核糖核蛋白U樣蛋白2能夠增加lncRNA CRNDE的穩(wěn)定性，并通過活化Ras/MAPK信號通路，促進腫瘤細胞增殖和遷移[17]。但結直腸癌組織lncRNA CRNDE表達與miR-181a表達的關系尚不清楚。本研究結果發(fā)現(xiàn)，結直腸癌組織lncRNA CRNDE表達與miR-181a表達呈明顯負相關關系。其機制可能是lncRNA CRNDE表達升高后，其結合miR-181a明顯增多，從而使miR-181a的腫瘤抑制功能受到抑制，結直腸癌細胞增殖和遷移能力明顯增強；而當敲除lncRNA CRNDE表達后，miR-181a表達明顯升高，其對腫瘤的促進作用得到逆轉。

綜上所述，結直腸癌組織miR-181a低表達、lncRNA CRNDE高表達，二者共同參與結直腸癌的惡性進展，有望成為結直腸癌早期診斷的指標和潛在的治療靶點。