王愛紅，趙菊梅，魏曉麗，龐秋霞，王明全

(1 延安大學醫(yī)學院，陜西延安716000；2 延安市腫瘤防治研究重點實驗室；3 延安大學附屬醫(yī)院)

肝癌是世界上癌癥相關死亡的主要原因之一，其中90%以上為肝細胞癌[1]。目前，肝細胞癌的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚。O-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化修飾是一種存在于細胞核及細胞質(zhì)的翻譯后修飾方式，可參與細胞的多種應激響應及細胞進程[2]。O-GlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶(OGT)和O-GlcNAc糖苷水解酶(OGA)是O-GlcNAc糖基化修飾過程中最重要的兩種酶。近年研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化可參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。血管生成素2(Ang2)是調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的關鍵因子[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌組織中Ang2表達明顯升高，且其表達與腫瘤惡性程度和患者預后密切相關[5]。本研究探討了肝細胞癌組織O-GlcNAc糖基化水平變化及其與Ang2表達的關系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年3月～2018年5月延安大學附屬醫(yī)院收治的初診肝細胞癌患者57例(觀察組)。所有患者入院前未行任何抗腫瘤治療，入院后接受手術治療并經(jīng)術后組織病理檢查明確診斷。排除合并其他重要臟器嚴重疾病者、不配合治療者以及存在手術禁忌證者。其中，男37例、女20例，年齡(51.6±6.7)歲，BMI(23.86±2.60)kg/m2；腫瘤直徑：≤3 cm 27例，>3 cm 30例；組織學分級：Ⅰ級14例，Ⅱ級13例，Ⅲ級30例；BCLC分期：0、A期37例，B、C期20例；有淋巴結轉(zhuǎn)移43例，無淋巴結轉(zhuǎn)移14例。同期選擇接受手術治療的肝臟良性占位性病變患者40例(對照組)，男23例、女17例，年齡(52.4±8.1)歲，BMI(24.11±2.74)kg/m2；疾病類型：肝血管瘤28例、肝炎性假瘤2例、肝局灶性結節(jié)性增生4例、肝腺瘤性結節(jié)性增生3例、肝局灶性脂肪變3例。兩組性別、年齡、BMI具有可比性。本研究經(jīng)延安大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 OGA、OGT、Ang2表達檢測 ①OGA、OGT、Ang2 mRNA表達檢測：采用RT-PCR法。取手術切除的肝細胞癌組織及肝臟良性占位性病變組織，采用TRIzol法提取組織總RNA。取總RNA 1 μg，按High-Capacity RNA-to-cDNATMKit說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按2×SYBR Green qPCR Mix說明進行PCR擴增。所有引物由上海彩佑實業(yè)有限公司設計合成。引物序列：OGA上游引物5′-TTCACTGAAGGCTAATGGCTCCCG-3′，下游引物5′-ATGTCACAGGCTCCGACCAAGT-3′；OGT上游引物5′-CATCGAGAATATCAGGCAGGAG-3′，下游引物5′-CCTTCGACACTGGAAGTGTATAG-3′；Ang2上游引物5′-TCCAAGAGCTCGGTTGCTAT-3′，下游引物5′-AGTTGGGGAAGGTCAGTGTG-3′；β-actin上游引物5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′。PCR反應體系共50 μL：2×SYBR Mixture(with ROX)25 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，RNase-free水補足至50 μL；反應條件：95 ℃ 10 min，95℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。②OGA、OGT、Ang2蛋白表達檢測：采用Westen blotting法。取手術切除的肝細胞癌組織及肝臟良性占位性病變組織，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取組織總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白20 μL，SDS-PAGE(8%濃縮膠、5%分離膠)分離蛋白，并將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入OGA、OGT、Ang2、β-actin一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育1 h。ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影。采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描各蛋白電泳條帶，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 兩組OGA、OGT、Ang2 mRNA和蛋白表達比較 見表1。

表1 兩組OGA、OGT、Ang2 mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 OGA、OGT表達與Ang2表達的關系 相關分析顯示，OGA、OGT mRNA表達與Ang2 mRNA表達均呈正相關關系(r分別為0.59、0.65，P均<0.05)，OGA、OGT蛋白表達與Ang2蛋白表達亦呈正相關關系(r分別為0.44、0.57，P均<0.05)。

2.3 肝細胞癌組織OGA、OGT、Ang2蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 見表2。

表2 肝細胞癌組織OGA、OGT、Ang2蛋白表達與患者臨床病理特征的關系

3 討論

O-GlcNAc糖基化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式。近年研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)O-GlcNAc糖基化可參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。OGT可增加p-JNK、p-c-Jun蛋白表達和AP-1激活，從而激活JNK/c-Jun/AP-1級聯(lián)反應，并提高p-IKKα/β、p-p65、p-p50、NF-κB的DNA結合活性，激活NF-κB信號通路，促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[6]。糖基化終末產(chǎn)物特異性受體能夠通過該蛋白在Ser73上的O-GlcNAc糖基化提高原癌蛋白c-Jun的活性和穩(wěn)定性[7]。OGT蛋白還可調(diào)節(jié)E-選擇素基因的啟動子活性、抑制cAMP反應元件、增強AP-1和E-選擇素表達，促進惡性腫瘤浸潤和侵襲[8]。OGA能去除O-GlcNAc糖基化修飾。有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織OGA活性明顯升高，其活性越高，腫瘤侵襲性越強[9]。以上結果表明，O-GlcNAc糖基化可能在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

血管生成是腫瘤形成中的標志性事件。Tie2是內(nèi)皮細胞上特異的酪氨酸激酶型受體，為Ang1和Ang2的共同受體。Ang1作為促血管生成因子，能夠通過激活并磷酸化Tie2，促進血管成熟并維持血管結構。Ang2作為Ang1的拮抗劑，能夠競爭性抑制Ang1的作用，從而降低血管穩(wěn)定性。腫瘤組織Ang2表達升高，可促進腫瘤生成、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。Chen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織Ang2 mRNA表達明顯升高，且其高表達與患者預后不良明顯相關；而使用特異性shRNA抑制Ang2表達，肝癌細胞增殖速率明顯受到抑制。結果表明，Ang2可能在肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。

O-GlcNAc糖基化與腫瘤血管生成的關系是目前臨床研究的熱點。果糖-6-磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶1(GFAT1)是己糖胺生物合成途徑(HBP)中的限速酶，控制著O-GlcNAc糖基化修飾過程。GFAT1/HBP是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)調(diào)控血管生成的重要通路[11]。前列腺癌PC3-ML細胞中O-GlcNAc糖基化水平下降可導致MMP-2、MMP-9、VEGF表達下調(diào)，從而抑制腫瘤侵襲和血管生成[12]。此外，O-GlcNAc糖基化可增強絨毛膜癌JARR細胞黏附能力，促進腫瘤細胞遷移。有研究還發(fā)現(xiàn)，SP3蛋白的O-GlcNAc糖基化修飾水平增加可導致Ang2啟動子中葡萄糖反應性GC盒結合降低，導致Ang2表達增加[13]。由此推測，O-GlcNAc糖基化與腫瘤血管生成密切相關。

本研究結果顯示，觀察組OGA、OGT、Ang2 mRNA和蛋白表達均明顯高于對照組；相關分析顯示，OGA、OGT表達與Ang2表達均呈正相關關系；肝細胞癌組織OGA、OGT、Ang2蛋白表達均與BCLC分期有關，OGT、Ang2蛋白表達還與淋巴結轉(zhuǎn)移有關。提示三者均參與肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展，并且O-GlcNAc糖基化與Ang2具有協(xié)同促進作用。但O-GlcNAc糖基化與Ang2的協(xié)同作用機制還需進一步研究。

綜上所述，肝細胞癌組織O-GlcNAc糖基化水平明顯升高；O-GlcNAc糖基化有可能通過調(diào)節(jié)Ang2表達促進肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展。