唐楠，譚雪瑩，張德國，黃飛，史光軍

(1 濰坊醫(yī)學院，山東濰坊261000；2 青島大學附屬青島市市立醫(yī)院；3 大連醫(yī)科大學)

急性重癥胰腺炎(SAP)是臨床常見的急危重癥，起病急驟，病情兇險，是外科急腹癥中最棘手的疾病之一。目前，對于SAP的發(fā)病機制尚不完全清楚，一般認為與胰腺自身消化引起的瀑布式炎癥級聯(lián)效應有關(guān)；對于SAP的治療主要采取非手術(shù)為主的個體化綜合治療，如胃腸減壓、抑制消化液分泌、液體復蘇等對癥支持治療。近年隨著治療方法的改進，SAP的臨床救治成功率不斷提高，但其病死率仍然在10%左右[1，2]。干細胞移植是將具有自我復制能力的多潛能細胞移植到患者體內(nèi),修復或替換受損細胞或組織，從而達到治療疾病的目的。有研究報道，通過尾靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)能夠減輕SAP大鼠胰腺炎癥反應[3]。但BMSCs來源匱乏，不適合治療性研究。脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)是來源于脂肪組織的多潛能細胞，其作用效果與BMSCs相似，而且組織相容性復合體Ⅰ低表達，可逃避免疫系統(tǒng)識別，無需配型[4]。此外，脂肪組織來源廣泛，ADSCs取材容易[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠體內(nèi)ADSCs向胰島細胞分化、增殖和遷移的能力均明顯優(yōu)于BMSCs[6，7]。本課題組前期研究證實，ADSCs能明顯減輕SAP大鼠胰腺炎癥反應。但對ADSCs治療SAP的具體作用機制仍不十分清楚。2018年5～6月，本研究觀察了人ADSCs對大鼠SAP的治療作用及其可能的作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠45只，清潔級，鼠齡40～50 d，體質(zhì)量200～230 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物許可證號：SCXK(魯)20140007。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～25 ℃、相對濕度40%～60%，光照12 h明暗交替。實驗期間自由攝食、飲水。人ADSCs由青島市市立醫(yī)院肝膽胰外科細胞移植實驗室凍存。所有PCR引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司設(shè)計合成。Light Cycle96實時熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；流式細胞儀，美國BD公司。PrimeScript RT Reagent Kit，日本TaKaRa公司；iQTMSYBR Green Supermix，美國Sigma公司；兔抗鼠磷酸化β-actin(p-β-actin)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)一抗，沈陽萬類生物科技有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，南京生興生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物分組處理 所有SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，隨機分為假手術(shù)組、模型組、移植組，每組15只。各組術(shù)前禁食12 h，自由飲水。模型組、移植組異氟烷吸入麻醉，經(jīng)上腹劍突下正中切口入腹，用微型血管夾夾閉膽總管近肝門處，按胰膽管逆行注射?；悄懰徕c法[8]建立SAP模型。當觀察到胰腺充血、水腫，移植組用注射器于胰腺被膜下注射密度為1×106個/mL的人ADSCs懸液300 μL后關(guān)腹。模型組觀察到胰腺充血、水腫后關(guān)腹。假手術(shù)組開腹后經(jīng)胰膽管逆行注射臺式液。

1.3 各組腹水量與血清淀粉酶、TNF-α檢測 ①腹水量檢測：移植組于移植6、12、24 h分別取5只，假手術(shù)組與模型組同期各取5只，異氟烷吸入麻醉滿意后，平臥位固定于手術(shù)臺上，開腹，用5 mL注射器抽取腹水，記錄腹水量。②血清淀粉酶、TNF-α檢測：抽取腹水后，心尖部采血，4 ℃靜置3 h，3 000 r/min離心10 min，取上層血清。采用ELISA法檢測血清淀粉酶、TNF-α。

1.4 胰腺組織形態(tài)學觀察 各組心尖部取血后，斷頸處死，迅速完整分離胰腺組織。取部分胰頭組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察胰頭組織形態(tài)學改變。

1.5 胰頭組織p-AKT、p-NF-κB mRNA與蛋白表達檢測 ①胰頭組織p-AKT、p-NF-κB mRNA表達檢測：采用RT-PCR法。取血清淀粉酶、TNF-α水平變化最明顯時胰頭組織，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可進行后續(xù)實驗。按PrimeScript RT Reagent Kit說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，按iQTMSYBR Green Supermix說明進行PCR擴增。引物序列：p-AKT上游引物5′-GTGCTGGAGGACAATGACTACGG-3′，下游引物5′-AGCAGCCCTGAAAGCAAGGA-3′；p-NF-κB上游引物5′-CTACTGTTCAGTGTTCAAGCAGTGA-3′，下游引物5′-CAGTGCAATATAGCATTGCAGTAGC-3′；β-actin上游引物5′-GCCAACCGTGAAAAGATG-3′，下游引物5′-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3′。PCR反應體系共10 μL：2×Easy Taq PCR Supermix 5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，雙蒸水1 μL；反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s共30個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。②胰頭組織p-AKT、p-NF-κB蛋白表達檢測：采用Western blotting法。取血清淀粉酶、TNF-α水平變化最明顯時胰頭組織，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取組織總蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量合格。然后加入4×上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白12 μg，經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白(5%濃縮膠、10%分離膠)，80 V電壓電泳30 min，當溴酚藍跑至分離膠時，更換至120 V電壓，直至溴酚藍跑至凝膠底部，結(jié)束電泳。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2～3 h，分別加入p-β-actin(稀釋比1∶2 000)、p-AKT(稀釋比1∶200)、p-NF-κB(稀釋比1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶2 000)，室溫孵育2 h。最后ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影，實時熒光檢測系統(tǒng)拍照。采用Image-Pro Plus6.0軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組移植不同時間腹水量和血清淀粉酶、TNF-α水平比較 假手術(shù)組移植6、12、24 h腹水色清、量少，血清淀粉酶、TNF-α水平變化不明顯。模型組移植6 h即有大量紅褐色腹水，隨著移植時間延長逐漸增多，血清淀粉酶、TNF-α水平在移植24 h內(nèi)先升高后降低。移植組移植6、12、24 h腹水量較模型組同期均降低，但差異均無統(tǒng)計學意義；而血清淀粉酶、TNF-α水平較模型組同期均明顯降低(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組胰頭組織形態(tài)學觀察 假手術(shù)組胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，大部分腺泡小葉完整，無明顯炎性細胞浸潤，未見間質(zhì)充血、出血和腺泡細胞壞死；隨著時間推移，胰腺組織和細胞并未見明顯改變。模型組胰腺組織結(jié)構(gòu)不清，腺泡小葉結(jié)構(gòu)破壞，組織間隙水解消失，小葉間水腫，胰腺細胞無法辨認，伴有大量炎性細胞浸潤，并有明顯出血灶和壞死灶；隨著時間推移，胰腺組織水解、細胞壞死及炎性細胞浸潤逐漸加重。移植組胰腺組織結(jié)構(gòu)尚清晰，組織間隔清楚，胰腺細胞腫脹，伴有少量炎性細胞浸潤，偶見點狀出血，未見腺泡細胞壞死。隨著時間推移，胰腺組織水解、炎性細胞浸潤進一步加重，但仍可見其基本結(jié)構(gòu)。

表1 各組不同時間腹水量和血清淀粉酶、TNF-α水平比較

注：與假手術(shù)組同期比較，*P<0.05；與模型組同期比較，#P<0.05。

2.3 各組胰腺組織p-AKT、p-NF-κB mRNA與蛋白表達比較 見表2。

表2 各組胰腺組織p-AKT、p-NF-κB mRNA與蛋白相對表達量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

隨著對SAP發(fā)病機制的深入研究和臨床救治水平的提高，其病死率得到明顯控制，已降至10%左右[9，10]。目前關(guān)于SAP具體的發(fā)病機制尚不完全清楚，比較公認的是“二次打擊”學說。所謂“二次打擊”就是急性胰腺炎早期，胰腺組織損傷后釋放大量炎性因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β等，在血液循環(huán)中形成第一次高峰，這些炎性介質(zhì)可導致腸黏膜屏障功能障礙，進而引起腸道菌群易位，形成內(nèi)毒素血癥，從而導致胰腺組織繼發(fā)感染、炎性因子瀑布式激活、炎性細胞浸潤，造成胰腺組織水腫、出血和壞死，進一步發(fā)展為全身炎性反應綜合癥和多器官功能衰竭[11]。而NF-κB作為這一機制的“扳機點”，其作用更是不可小覷[12,13]。NF-κB是一種多向性核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)蛋白，作為SAP發(fā)病機制的核心環(huán)節(jié)之一，一方面NF-κB激活可上調(diào)細胞內(nèi)P-選擇素、細胞間黏附因子1表達，從而使多形核中性粒細胞趨化而貼壁和滲出，進而導致胰腺組織水腫與炎性細胞浸潤[11]；另一方面NF-κB激活后，迅速入核與特定的基因啟動子或增強子結(jié)合，從而上調(diào)其細胞因子和炎性因子基因轉(zhuǎn)錄與表達，導致血清TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性介質(zhì)水平明顯升高，進而造成“炎癥瀑布”[14]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號轉(zhuǎn)導通路是介導細胞外信號引起細胞反應的重要信號調(diào)控系統(tǒng)，可參與機體多種病理生理過程，如腫瘤形成、應激反應、炎性反應等。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路可明顯減輕膿毒血癥、長期機械通氣所引起的炎性反應[15,16]；而且PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路能夠介導SAP大鼠中性粒細胞活化及炎性因子TNF-α、IL-1β生成[17]。目前認為，作為PI3K下游靶蛋白的AKT活化后，可使抑制蛋白IκBa磷酸化，繼而激活NF-κB[18，19]。這些理論為SAP治療提供了新的方向。

干細胞移植作為當今社會新興的再生醫(yī)療技術(shù)，在治療神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等疾病方面較傳統(tǒng)治療方法具有不可比擬的效果。根據(jù)干細胞來源不同，可分為BMSCs、ADSCs、胰腺干細胞等。針對SAP治療，最理想的是胰腺干細胞，但由于其數(shù)量少、提純困難等因素，無法滿足臨床治療需要。已有研究證實，BMSCs、ADSCs亦能定向分化為胰腺細胞[20，21]。但BMSCs來源匱乏，不適合治療性研究。ADSCs的作用效果與BMSCs相似，而且組織相容性復合體Ⅰ低表達，可逃避免疫系統(tǒng)識別，無需配型[4]。此外，脂肪組織來源廣泛，ADSCs取材容易[5]。本課題組前期研究證實，人ADSCs經(jīng)大鼠尾靜脈注射，可定向遷移至胰腺組織，發(fā)揮相應的修復或治療作用。但目前對ADSCs治療SAP的具體作用機制尚不清楚。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人ADSCs經(jīng)SAP大鼠尾靜脈注射，可抑制體內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-10等炎性因子釋放[22～24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著移植時間延長，移植組和模型組腹水量較假手術(shù)組均逐漸增多，雖然移植組各時間腹水量均低于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義；移植組和模型組各時間血清淀粉酶、TNF-α水平均明顯高于對照組，但移植組血清淀粉酶、TNF-α水平較模型組同期均明顯降低；移植組胰頭組織水腫、壞死及炎性細胞浸潤情況均較模型組輕微。結(jié)果表明人ADSCs移植對大鼠SAP具有一定治療作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，模型組p-AKT、p-NF-κB mRNA與蛋白相對表達量均明顯高于假手術(shù)組，而移植組p-AKT、p-NF-κB mRNA與蛋白相對表達量均明顯低于模型組。表明人ADSCs可能是通過抑制AKT磷酸化進而抑制NF-κB激活，產(chǎn)生弱化“二次打擊”扳機點作用，而且這種作用在炎癥早期較為明顯，隨著炎癥時間推移逐漸減弱。這為SAP早期ADSCs移植治療奠定了基礎(chǔ)。

綜上所述，人ADSCs移植對大鼠SAP具有一定治療作用，其作用機制可能與抑制AKT磷酸化進而抑制NF-κB激活，繼而產(chǎn)生弱化“二次打擊”扳機點作用有關(guān)。但本研究尚有許多不足之處，如各指標觀察時間過長、炎癥因子TNF-α釋放減少的分子機制是抑制AKT磷酸化的證據(jù)相對不足等，這些問題有待于今后進一步研究論證。