左金玲，欒青春，姜海英，李靜，崔春柳

(1 唐山市婦幼保健院，河北唐山063000；2 唐山弘慈醫(yī)院)

重度子癇前期是妊娠期高血壓疾病中較為常見的一種類型，是導致孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡的重要原因之一[1]。重度子癇前期的基本病理生理變化是全身小動脈痙攣，臨床表現(xiàn)為孕婦高血壓、水腫、蛋白尿，胎兒生長受限、羊水過少和胎兒宮內(nèi)窘迫等，妊娠晚期甚至出現(xiàn)抽搐、昏迷等緊急情況，同時可并發(fā)腎功能衰竭、心力衰竭、肺水腫等。近年越來越多研究表明，重度子癇前期一系列病理生理變化可能是由機體內(nèi)在多個因素影響不同的易感基因或影響同一易感基因的多個相關(guān)位點以及與后天環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[2]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是一種激素內(nèi)分泌系統(tǒng)，通過自分泌和旁分泌兩種方式來維持血壓和體內(nèi)水、電解質(zhì)平衡。血管緊張素原(AGT)是RAS的重要活性成分之一。近年國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AGT基因M235T位點基因突變可使血液循環(huán)中AGT活性升高，該位點基因多態(tài)性與高加索人和亞洲人先兆子癇的易感性有關(guān)，并可增加冠心病、心肌梗死等疾病的發(fā)生風險，但該位點基因多態(tài)性與重度子癇前期的關(guān)系仍存在爭議[3～6]。為此，本研究探討了AGT基因M235T位點多態(tài)性與重度子癇前期的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年11月～2011年7月在唐山市婦幼保健院住院并擇期行剖宮產(chǎn)的重度子癇前期孕婦133例(觀察組)，均符合《婦產(chǎn)科學》(第9版)重度子癇前期的診斷標準[7]。孕婦年齡(28.62±3.38)歲，BMI(30.65±3.63)kg/m2，SBP(163.19±11.53)mmHg，DBP(99.98±10.40)mmHg，孕周(36.17±2.57)周。選擇同期在唐山市婦幼保健院住院但無指征剖宮產(chǎn)的正常孕婦93例(對照組)，年齡(28.05±2.97)歲，BMI(28.33±3.77)kg/m2，SBP(120.28±9.89)mmHg，DBP(75.41±8.19)mmHg，孕周(36.77±2.78)周。兩組均為唐山市常住漢族人，單胎妊娠，無血緣關(guān)系，無異族通婚家族史。排除合并心臟病、糖尿病、腎病等內(nèi)科疾病者，慢性高血壓合并妊娠、慢性高血壓合并子癇前期等其他產(chǎn)科并發(fā)癥者，以及有吸煙、酗酒、藥物濫用或精神性疾病史者。兩組年齡、孕周比較P均>0.05，BMI、SBP、DBP比較P均<0.05。本研究經(jīng)唐山市婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 AGT基因M235T位點多態(tài)性檢測 ①DNA提?。翰杉性袐D術(shù)日清晨無宮縮狀態(tài)下外周靜脈血3 mL，EDTA抗凝，低滲法分離白細胞，氯仿/異戊醇法提取DNA，并置于EP管中，-80 ℃保存。②PCR擴增：參照Russ等[8]的研究設(shè)計引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。AGT基因M235T位點上游引物5′-CGTTTGTGCAGGGCCTGGCTCTC-3′，下游引物5′-AGGGTGCTGTCCACACTGGACCC-3′(AC為非配對堿基，AGT基因第2外顯子704位點突變?yōu)镃，產(chǎn)生一個適合的酶切“半位點”，與之對應(yīng)的另一個“半位點”是通過兩個非配對堿基的引入來完成，這兩個非配對堿基并不影響引物延伸)。以提取的DNA為模板，采用9700型PCR擴增儀(GeneAmp PCR system 9700)進行擴增。PCR反應(yīng)體系共25 μL：無菌去離子雙蒸水8.5 μL，2×Taq Master Mix(含Taq DNA Polymerase、2×Taq PCR Buffer、3 mmol/L MgCl2、400 μmol/L dNTP Mix) 12.5 μL，引物2 μL，模板DNA 2 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s、60 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。③PCR產(chǎn)物酶切：取PCR擴增產(chǎn)物10 μL，加入限制性片段長度多態(tài)性酶切反應(yīng)體系(無菌去離子雙蒸水6 μL、10×Buffer B 2 μL、10 U/μL限制性內(nèi)切酶Tth111 Ⅰ 2 μL)，37 ℃水浴過夜。次日，酶切產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳下分離，紫外燈下觀察。結(jié)果判定：PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Tth111 Ⅰ消化，若兩個等位基因均含內(nèi)切酶識別位點，即為TT型(突變型)，酶切后產(chǎn)生140、23 bp兩個片段，電泳后可見一個140 bp片段，由于23 bp片段過小，電泳后不顯示；若兩個等位基因中只含有一個內(nèi)切酶識別位點，即為MT型(雜合子型)，酶切后產(chǎn)生163、140、23 bp三個片段，電泳后可見163、140 bp兩個片段；若兩個等位基因中不含內(nèi)切酶識別位點則不被酶切，即為MM型(野生型)，電泳后可見一個163 bp片段。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。采用比值比(OR)評價可能致病因素的影響，并計算其95%可信區(qū)間(95%CI)。樣本代表性分析采用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組AGT基因M235T位點基因型和等位基因分布比較 兩組AGT基因M235T位點基因型和等位基因分布比較差異均有統(tǒng)計學意義(χ2分別為6.219、5.461，P均<0.05)。見表1。兩組在校正高血壓史這一混雜因素后，MT基因型者罹患重度子癇前期的危險性是MM基因型者的2.284倍(校正OR=2.284，95%CI：1.169～4.461，P<0.05)；TT基因型者罹患重度子癇前期的危險性是MM基因型者的3.910倍(校正OR=3.910，95%CI：1.532～9.982，P<0.01)。觀察組AGT基因M235T位點TT基因型頻率明顯高于對照組，T等位基因頻率亦明顯高于對照組(P均<0.05)。

2.2 兩組群體代表性分析 根據(jù)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，觀察組MM、MT、TT基因型理論值分

表1 兩組AGT基因M235T位點基因型和等位基因分布情況

別為32.7、66.5、33.8，實際值分別為29、74、30；對照組MM、MT、TT基因型理論值分別為34.4、44.3、14.3，實際值分別為31、51、11。兩組MM、MT、TT基因型理論值與實際值比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明研究對象具有群體代表性。

3 討論

重度子癇前期是以孕期高血壓、水腫、蛋白尿為主要臨床表現(xiàn)，以胎盤淺著床為主要病理表現(xiàn)的妊娠期高血壓疾病，一旦發(fā)生，對孕婦和胎兒的危害都是巨大的，甚至可能危及母兒生命。重度子癇前期的基本病理生理變化是全身小動脈痙攣，妊娠晚期可出現(xiàn)抽搐、昏迷等緊急情況，同時可并發(fā)腎功能衰竭、心力衰竭、肺水腫等。重度子癇前期的發(fā)病機制仍不十分清楚，目前已形成多種學說，如血管內(nèi)皮損傷學說、免疫學說、胎盤缺血學說等，均可在某一方面闡釋其發(fā)病機制。近年隨著分子生物醫(yī)學發(fā)展，越來越多與重度子癇前期相關(guān)的基因被定位、克隆，這為探索重度子癇前期發(fā)病的分子機制提供了新思路。

RAS是一種激素內(nèi)分泌系統(tǒng)，是體內(nèi)調(diào)節(jié)體液平衡、攝鹽和血壓的重要系統(tǒng)，可通過多種途徑來影響人體血壓[9～11]。AGT是RAS的重要活性成分之一。AGT基因有可能是子癇前期發(fā)病的易感基因。AGT是腎素作用的惟一底物，是血管緊張素Ⅱ(AT-Ⅱ)惟一的前身物質(zhì)，是所有血管緊張肽的獨特底物[12]；作為血管緊張素肽類的細胞外儲備，其活性變化可限制AT-Ⅱ的轉(zhuǎn)化速度。因此，AGT在RAS中具有舉足輕重的作用。AGT的相對分子質(zhì)量為49.8×103，與腎素位點相近，其編碼基因位于常染色體1q42～43處，長度約12 kb。Jeunemaitre等[13]研究發(fā)現(xiàn)，AGT基因結(jié)構(gòu)上存在16個多態(tài)性位點，除3′端存在二核苷酸重復序列(GT)n多態(tài)性外，其他15個均為單堿基變異，其中5種位于5′非翻譯區(qū)、10種為編碼區(qū)的無義或錯義突變。目前研究最廣泛、最深入的位點是M235T，位于第2個外顯子704位核苷酸處，該位點處胸腺嘧啶被胞嘧啶所取代，導致編碼產(chǎn)物第235位氨基酸由蛋氨酸變?yōu)樘K氨酸。這個位點突變可影響AGT活性，繼而造成機體對某些疾病的易感性增加。有研究認為，AGT基因M235T位點多態(tài)性與重度子癇前期的發(fā)病有關(guān)，但目前還存在爭議。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組AGT基因M235T位點基因型和等位基因分布比較差異均有統(tǒng)計學意義。表明AGT基因M235T位點多態(tài)性與重度子癇前期的發(fā)病有關(guān)，與Zitouni等[14]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，兩組在校正高血壓史這一混雜因素后，MT基因型者罹患重度子癇前期的危險性是MM基因型者的2.284倍；TT基因型者罹患重度子癇前期的危險性是MM基因型者的3.910倍。表明AGT基因M235T位點MT基因型和TT基因型可增加罹患重度子癇前期的風險，與宋成文等[15]研究結(jié)果相似。兩組MM、MT、TT基因型理論值與實際值比較差異均無統(tǒng)計學意義，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，說明研究對象具有群體代表性。但重度子癇前期的發(fā)病受多基因、多因素影響，國內(nèi)外學者對AGT基因M235T位點多態(tài)性的研究結(jié)果存在分歧，可能是由于該位點多態(tài)性存在種族差異[16]，也可能與樣本數(shù)量或樣本選擇有關(guān)。

綜上所述，AGT基因M235T位點多態(tài)性與重度子癇前期的發(fā)病有關(guān)，尤其是TT基因型。本研究從遺傳學角度觀察了AGT基因M235T位點多態(tài)性與重度子癇前期發(fā)病的關(guān)系，這為研究重度子癇前期的發(fā)病機制提供了一定分子遺傳學依據(jù)。