張海雄，彭亮，馮偉清

(廣東醫(yī)科大學附屬佛山禪城中心醫(yī)院，廣東佛山528000)

肝細胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌中最常見的一種類型，占原發(fā)性肝癌的70%～85%。目前，手術切除仍是HCC的首選治療方法，也是最有效的治療方法[1]。但HCC早期易侵襲和轉移，患者術后5年生存率較低[2，3]。目前對HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚不完全清楚。微小RNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物體內的內源性非編碼小分子RNA，長度19～25個核苷酸，主要通過結合靶基因mRNA的3′UTR區(qū)，參與基因轉錄后調控。已有研究證實，miRNA可通過調控癌基因或抑癌基因表達，參與腫瘤細胞增殖、分化、凋亡等生物學過程。miR-221是近年發(fā)現的miRNA，屬于miR-221/222基因家族成員之一。有研究發(fā)現，在多種惡性腫瘤組織中miR-221表達異常增高，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[4]。但在HCC組織中miR-221表達變化的報道較少，其能否參與HCC的發(fā)生、發(fā)展亦不十分清楚。為此，本研究觀察了原發(fā)性HCC組織miR-221表達變化，并探討其表達變化對腫瘤侵襲和轉移的影響?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2014年6月～2017年6月廣東醫(yī)科大學附屬佛山禪城中心醫(yī)院手術切除的HCC組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣≥2 cm)各74例份。所有標本經組織病理學檢查證實。標本來源患者均為初診原發(fā)性HCC，術前未接受任何抗腫瘤治療，且未合并其他組織或器官惡性腫瘤。其中，男54例、女20例，年齡(52.4±12.6)歲；合并癥：肝硬化48例，HBV感染60例；腫瘤直徑：≥5 cm 40例，<5 cm 34例；腫瘤數量：單發(fā)58例，多發(fā)16例；Edmondson-Steiner分級：Ⅰ、Ⅱ級48例，Ⅲ、Ⅳ級26例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期45例，Ⅲ、Ⅳ期29例；有微血管侵犯30例，無微血管侵犯44例。本研究經廣東醫(yī)科大學附屬佛山禪城中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

高侵襲性HCC細胞株MHCC97H、低侵襲性HCC細胞株MHCC97L及正常肝細胞株L02(以下分別稱MHCC97H、MHCC97L、L02細胞)，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。LightCycler?96實時熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司。miR-221抑制物(miR-221 inhibitor)及其陰性對照物(NC inhibitor)，購自上海吉瑪制藥技術有限公司；miR-221及內參U6引物序列，由廣州市銳博生物科技有限公司設計合成。TRIzol、LipofectamineTM2000，美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser)、實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ)，日本TaKaRa公司；纖維連接蛋白(Fibronectin)、四甲基偶氮唑藍(MTT)，美國Sigma公司；Transwell小室，美國Corning公司；Matrigel膠，美國BD公司。

1.2 HCC組織與癌旁正常組織miR-221表達檢測 采用RT-qPCR法。取手術切除的HCC組織及其配對的癌旁正常組織，液氮中充分研磨，采用TRIzol法提取組織總RNA。經紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，表明提取的總RNA濃度和純度合格。按PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser說明將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明進行PCR擴增。引物序列：miR-221上游引物5′-CAAGGAATCATGTATGCTGTAG-3′，下游引物5′-AGGATGACATTACACCTTATCTC-3′；U6上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。PCR反應體系共25 μL：SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2×)12.5 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，無酶水8.5 μL；反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環(huán)。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。以miR-221表達的均數為截斷值，將HCC組織分為miR-221高表達與miR-221低表達，分析不同miR-221表達與患者臨床病理特征的關系。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞傳代培養(yǎng) 將MHCC97H、MHCC97L、L02細胞分別接種于含10% FBS、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d更換1次新的培養(yǎng)基。當細胞生長融合80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，每2～3 d按1∶3傳代1次。取傳3代、對數生長期、生長狀態(tài)良好細胞進行后續(xù)實驗。

1.3.2 各細胞miR-221表達檢測 采用RT-qPCR法。取傳3代、對數生長期、生長狀態(tài)良好的MHCC97H、MHCC97L、L02細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，按1.2中的方法進行逆轉錄和PCR擴增。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。選擇miR-221相對表達量最高的細胞系進行后續(xù)實驗。

1.3.3 細胞分組與轉染 將上述miR-221相對表達量最高的細胞接種于6孔板，隨機分為觀察組和對照組，然后置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長融合60%～80%時，按LipofectamineTM2000說明，觀察組加入100 pmol miR-221 inhibitor和5 μL LipofectamineTM2000轉染試劑，對照組加入100 pmol NC inhibitor和5 μL LipofectamineTM2000轉染試劑。轉染24 h，收集細胞，采用RT-qPCR法檢測miR-221表達，具體方法參照1.2。每組設6個復孔，實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 細胞黏附能力檢測 采用細胞-基質黏附實驗。將96孔板分別用Fibronectin或Matrigel膠包被，37 ℃孵育過夜；次日，每孔加入2%牛血清白蛋白75 μL，37 ℃孵育1 h。收集兩組轉染24 h細胞，用含0.1%牛血清白蛋白的DMEM培養(yǎng)液重懸，制成密度為5×105個/mL的細胞懸液。取細胞懸液100 μL接種于已包被基質膠的96孔板中，37 ℃孵育1 h；棄培養(yǎng)基，PBS徹底清洗，去除未黏附細胞，然后每孔加入10 μL MTT，37 ℃孵育4 h；去除孔內培養(yǎng)基，加入100 μL二甲基亞砜，充分溶解結晶。酶標儀于490 nm波長處檢測各孔的OD值。以OD490值表示細胞黏附能力。每組設5個復孔，實驗重復3次，取平均值。

1.3.5 細胞侵襲和遷移能力檢測 ①細胞侵襲能力檢測：采用Transwell侵襲實驗。Matrigel膠4 ℃過夜融化，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基按1∶5稀釋后，包被Transwell小室上室的基底膜，然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱1 h，待Matrigel膠凝固。收集兩組轉染24 h細胞，用無血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，制成密度為1×105個/mL的細胞懸液。取細胞懸液200 μL加入Transwell小室上室，下室加入600 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，取出小室，用棉簽輕輕拭去上室未穿透細胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察。隨機取5個200倍視野，計數穿膜細胞數。以穿膜細胞數表示細胞侵襲能力。實驗重復3次，取平均值。②細胞遷移能力檢測：采用Transwell遷移實驗。除了不用Matrigel膠包被Transwell小室上室的基底膜外，其余同Transwell侵襲實驗。

2 結果

2.1 HCC組織與癌旁正常組織miR-221表達比較 HCC組織與癌旁正常組織miR-221相對表達量分別6.78±0.39、0.98±0.05，二者比較P<0.05。

2.2 HCC組織miR-221表達與患者臨床病理特征的關系 74例份HCC組織中，miR-221高表達39例份、miR-221低表達35例份。HCC組織miR-221高表達與Edmondson-Steiner分級、微血管侵犯和臨床分期有關(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤數目、肝硬化、HBV感染無關(P均>0.05)。見表1。

2.3 MHCC97H、MHCC97L、L02細胞miR-221表達比較 MHCC97H、MHCC97L、L02細胞miR-221相對表達量分別為9.47±0.43、5.26±0.36、1.02±0.06。MHCC97H、MHCC97L細胞miR-221相對表達量均明顯高于L02細胞，且MHCC97H細胞miR-221相對表達量明顯高于MHCC97L細胞(P均<0.05)。

2.4 兩組miR-221表達比較 轉染24 h，觀察組與對照組miR-221相對表達量分別0.27±0.09、1.05±0.05，兩組比較P<0.05。

2.5 兩組細胞黏附能力比較 用Fibronectin包被時，觀察組與對照組細胞黏附能力分別為0.266±0.021、0.398±0.032；用Matrigel膠包被時，觀察組與對照組細胞黏附能力分別為0.295±0.011、0.423±0.023。兩組比較P均<0.05。

表1 HCC組織不同miR-221表達與患者臨床病理特征的關系(例)

2.6 兩組細胞侵襲能力比較 觀察組與對照組穿膜細胞數分別(35±8)、(140±23)個，兩組比較P<0.05。

2.7 兩組細胞遷移能力比較 觀察組與對照組穿膜細胞數分別(119±19)、(281±40)，兩組比較P<0.05。

3 討論

原發(fā)性肝癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，HCC是其最常見的類型。目前，手術切除仍是HCC的首選治療方法。由于HCC侵襲性強、惡性程度高、進展速度快，早期易侵襲和轉移，故其術后5年生存率較低[5，6]。但目前對HCC侵襲和轉移的分子機制尚不十分清楚。

miRNA是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，能夠通過堿基配對的方式結合到靶基因mRNA的3′UTR區(qū)，從而抑制靶基因翻譯，在機體生理或病理生理過程中發(fā)揮重要作用[7]。有研究證實，miRNA在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色[8]。miR-221是近年發(fā)現的miRNA家族成員之一，屬miR-221/222基因家族，其染色體定位于Xp11.3。有研究證實，miR-221在多種惡性腫瘤中具有癌基因作用，如胰腺癌、結腸癌、卵巢癌等[9～13]，可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移等惡性生物學行為。但在HCC組織中miR-221表達的報道較少，其能否參與HCC的發(fā)生、發(fā)展亦不十分清楚。本研究結果發(fā)現，HCC組織miR-221相對表達量明顯高于癌旁正常組織，且其高表達與Edmondson-Steiner分級、微血管侵犯和臨床分期有關。提示miR-221在HCC中亦具有癌基因作用，可參與其發(fā)生、發(fā)展。本研究還觀察了MHCC97H、MHCC97L、L02細胞miR-221表達變化，結果發(fā)現，MHCC97H細胞和MHCC97L細胞miR-221相對表達量明顯高于L02細胞，與miR-221在其他惡性腫瘤細胞中的表達一致，并且MHCC97H細胞miR-221相對表達量明顯高于MHCC97L細胞。進一步說明，miR-221可能參與HCC的發(fā)生、發(fā)展。

侵襲和轉移是惡性腫瘤最基本的生物學特征，也是影響患者預后的重要原因。腫瘤細胞與細胞外基質黏附以及侵襲和遷移是腫瘤轉移過程中的關鍵環(huán)節(jié)。為了觀察miR-221對HCC細胞與細胞外基質黏附、侵襲和遷移能力的影響，我們通過脂質體轉染法將miR-221抑制物轉染至MHCC97H細胞，成功下調了MHCC97H細胞miR-221表達，采用細胞-基質黏附實驗檢測兩組細胞黏附能力變化，結果發(fā)現，無論采用Fibronectin包被還是采用Matrigel膠包被，觀察組細胞黏附能力均明顯低于對照組。進一步研究發(fā)現，觀察組細胞侵襲和遷移能力均明顯低于對照組。提示下調miR-221表達有可能抑制HCC細胞基質黏附、侵襲和遷移能力，這為HCC的分子靶向治療提供了依據。miRNA的功能主要取決于其所調控的下游靶基因功能，一個miRNA可能調控數十個甚至上百個靶基因，而一個靶基因可能收到數十個甚至上百個miRNA的調控。目前研究較多的miR-221下游靶基因有細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑Cip/Kip家族成員p27Kip1[14]和抑癌基因TP53INP1[15]、PTEN[16]以及堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子家族成員Twist2[17]等，這些靶基因的生物學功能不同，也決定了miR-221在不同疾病進展過程中的作用不同。但miR-221調控HCC細胞侵襲和遷移的下游靶基因尚不明確，仍需進一步研究探索。

綜上所述，HCC組織miR-221表達明顯升高，其高表達可促進腫瘤的侵襲和轉移。下調miR-221表達能夠抑制HCC細胞的黏附、侵襲和遷移能力，這為HCC的分子靶向治療提供了依據。