錢偉明，王海燕，李可

(常州市武進中醫(yī)醫(yī)院，江蘇常州213161)

結(jié)腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率和病死率在我國呈明顯上升趨勢，已成為當今社會嚴重危脅居民健康的疾病之一[1]。結(jié)腸癌早期常無明顯癥狀，多數(shù)患者就診時已屬中晚期，即使能夠手術(shù)，也易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復發(fā)，患者5年生存率較低[2，3]。但目前對結(jié)腸癌發(fā)病的分子機制仍不十分清楚。Ras超家族是真核生物中普遍存在的一類小分子GTP結(jié)合蛋白，通過介導生長因子、細胞因子和多種細胞外信號傳導通路，調(diào)控細胞的生長、增殖、分化等生物學過程[4]。Ras超家族許多成員是癌基因，其基因突變或蛋白異常表達可導致腫瘤形成[5,6]。Ras蛋白特異性鳥苷酸釋放因子1(RASGRF1)是Ras蛋白的上游信號分子之一，能夠調(diào)控Ras蛋白表達。Deng等[7]研究發(fā)現(xiàn)，RASGRF1可作為星形細胞瘤的治療靶點之一。甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾方式，特定基因的甲基化可作為惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的標志[8]。有研究證實，RASGRF1異常甲基化與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[9]。但目前鮮見RASGRF1蛋白表達及其基因甲基化狀態(tài)與結(jié)腸癌關(guān)系的報道。為此，我們進行了本研究，旨在探討RASGRF1在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2017年12月常州市武進中醫(yī)醫(yī)院收治的初診結(jié)腸癌患者81例。納入標準：①經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷；②初診，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并嚴重影響免疫組化或甲基化特異性PCR(MSP)檢查結(jié)果的疾病者；③結(jié)腸癌組織邊界不清，難以取得癌旁非腫瘤組織者；④臨床病理資料不完整者。其中，男55例、女26例，年齡29～81歲(<50歲19例、≥50歲62例)；腫瘤直徑：<4 cm 38例，≥4 cm 43例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期35例，Ⅲ期39例；組織分化程度：高分化9例，中分化37例，低分化35例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例。本研究經(jīng)常州市武進中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

江蘇是一個經(jīng)濟大省，又是一個水利大省。江蘇的經(jīng)濟社會現(xiàn)代化發(fā)展，不僅需要水利提供更高標準的防洪安全保障，還需要提高水資源和水生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)支撐，以水利的現(xiàn)代化支撐和保障經(jīng)濟社會的現(xiàn)代化發(fā)展。

1.2 RASGRF1蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm)，常規(guī)石蠟包埋，10 μm厚連續(xù)切片。切片經(jīng)65 ℃烤片3 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。Tris-EDTA抗原修復液(pH 9.0)煮沸以修復抗原，自然冷卻至室溫。PBS沖洗5 min×3次，3% H2O2避光孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；PBS沖洗5 min×3次，10%正常羊血清封閉10 min，加入兔抗人RASGRF1一抗，4 ℃孵育過夜。次日，PBS沖洗5 min×3次，加入酶標抗兔聚合物二抗，室溫孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知RASGRF1抗原陽性切片作為陽性對照。

通過對教學知識點及技能點的分析梳理，結(jié)合電商職業(yè)技能鑒定要求，擬建實踐教學基地建筑面積約200平方米，按照企業(yè)實際電商工作場景，引入企業(yè)真實工作沒項目，設(shè)置4個電商(商務秘書)職業(yè)場景實驗室，細分為19個具體項目，配置76個標準工作位，并依據(jù)企業(yè)真實項目靈活調(diào)整，以培養(yǎng)學生電商(商務秘書)實踐應用和創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力為目標，將企業(yè)真實工作項目融入電商實踐課程。使教學內(nèi)容具體化、任務化、場景化。每個項目任務都是電商(商務秘書)一項場景實驗室系列學習任務，教學內(nèi)容安排圍繞電商場景實驗室任務來完成。

采用雙盲法由兩位病理科高年資醫(yī)師獨立閱片。RASGRF1蛋白陽性染色定位于細胞質(zhì)，呈黃色至棕褐色，顆粒狀。每張切片隨機選取4個400倍不重疊視野，每視野計數(shù)至少100個細胞，評價染色強度，并計數(shù)陽性細胞比例。染色強度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例評分：≤5%為0分，>5%～33%計1分，>33%～66%計2分，>66%為3分。根據(jù)染色強度評分和陽性細胞比例評分綜合評價，二者乘積≥2為RASGRF1蛋白陽性表達。

2018年4月4日至5日西寧市嚴重污染天氣特征分析 馬學蓮 張青梅 馬海超 甘 璐 馬 麗 朱宇蓉 (4-176)

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3 RASGRF1基因甲基化檢測 采用MSP法。取手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織及其配對的癌旁正常組織，按Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit說明提取組織DNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續(xù)實驗。取組織DNA 2 μg，加入去離子水稀釋至50 μL，與3 mol/L氫氧化鈉溶液5.5 μL混勻，37 ℃水浴30 min；加入10 mmol/L氫醌30 μL，輕輕震蕩混勻；再加入3.6 mol/L亞硫酸氫鈉(pH 5.0)520 μL，輕輕震蕩混勻；-20 ℃保存?zhèn)溆?。所有引物由上海銘博生物科技有限公司設(shè)計合成。甲基化特異性引物：上游引物5′-TTGGACGTTTTTTGTAGTTTTATTTC-3′，下游引物5′-CCCGAAAATTTACGTCTTTACG-3′；非甲基化特異性引物：上游引物5′-TGGATGTTTTTGTAGTTTTATTTTGT-3′，下游引物5′-CATCCCAAAAATTTACATCTTTACAC-3′。PCR反應體系共25 μL：2×HotStar Taq PCR Buffer 10 μL，dNTP Mix 2 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，去離子水11 μL；反應條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸3 min。取PCR擴增產(chǎn)物10 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳分離甲基化與非甲基化條帶，采用凝膠成像儀于紫外線下拍照分析。結(jié)果判定：電泳結(jié)果中出現(xiàn)甲基化條帶伴或不伴非甲基化條帶擴增，判定為甲基化；電泳結(jié)果中僅出現(xiàn)非甲基化條帶擴增，而未出現(xiàn)甲基化條帶擴增，判定為非甲基化。

2 結(jié)果

2.3 結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達及其基因甲基化陽性與患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關(guān)(P均>0.05)；結(jié)腸癌組織RASGRF1基因甲基化陽性與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

RASGRF1基因是一種Ras蛋白激活因子，定位于人染色體25q15，長6 313 bp。RASGRF1是一種父系印記基因，其編碼的RASGRF1蛋白能促進Ras蛋白從Ras-GDP復合體中解離，進而與GTP結(jié)合形成Ras-GTP，從而激活特定的Ras信號通路。研究證實，RASGRF1能夠激活的Ras蛋白有K-Ras、H-Ras、N-Ras[12,13]。RASGRF1蛋白還可經(jīng)DHPH2介導直接與微管相連[11]，繼而參與細胞的諸多生物學過程。由于RASGRF1蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中表達較高，目前關(guān)于RASGRF1蛋白的研究主要集中在中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病[14]。近年研究發(fā)現(xiàn)，RASGRF1在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中亦具有重要作用[15,16]。Zhu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，RASGRF1蛋白可參與調(diào)控黑色素瘤細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶生成，從而影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；Sacco等[16]研究發(fā)現(xiàn)，無論是動物實驗還是細胞實驗，RASGRF1相關(guān)的衍生肽均可通過抑制Ras蛋白，達到抑制腫瘤細胞增殖和遷移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達率明顯低于癌旁正常組織；結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關(guān)。結(jié)果表明，RASGRF1蛋白在結(jié)腸癌組織中低表達，其低表達與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.1 結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織RASGRF1蛋白表達與基因甲基化比較 結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織RASGRF1蛋白陽性表達率分別為37.04%(30/81)、91.36%(74/81)，RASGRF1基因甲基化陽性率分別為70.37%(57/81)、18.52%(15/81)。結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達率明顯低于癌旁正常組織(χ2=51.995，P<0.01)，RASGRF1基因甲基化陽性率明顯高于癌旁正常組織(χ2=44.100，P<0.01)。

表1 結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達及其基因甲基化陽性與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

近年來，盡管我國臨床診療水平有了明顯提高，但受居民飲食結(jié)構(gòu)、生活習慣、環(huán)境變化等因素影響，結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率并未呈現(xiàn)出全球范圍內(nèi)的下降趨勢，反而呈上升趨勢[10]。中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2015年我國結(jié)腸癌新發(fā)病例37.6萬、死亡病例19.1萬，其發(fā)病率和病死率均居所有惡性腫瘤的第5位[11]。目前對結(jié)腸癌發(fā)病的具體分子機制仍不十分清楚。因此，探索與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子機制具有重要意義。

2.2 結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白表達與RASGRF1基因甲基化的關(guān)系 Spearman等級相關(guān)分析顯示，結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達與RASGRF1基因甲基化陽性呈負相關(guān)關(guān)系(ρ=-0.486，P<0.05)。

表觀遺傳學在基因表達的相關(guān)調(diào)控機制中具有重要作用。其中，DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的主要方式之一。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶第5位碳原子上，從而形成5-甲基胞嘧啶[17]。編碼蛋白質(zhì)基因的高甲基化狀態(tài)能直接阻礙基因轉(zhuǎn)錄，一般認為DNA非甲基化與基因活化相關(guān)，而DNA甲基化則與基因沉默相關(guān)，異常的DNA甲基化可導致基因表達異常。不同于基因突變等不可逆的經(jīng)典遺傳學現(xiàn)象，DNA甲基化是一種可逆的動態(tài)過程，去甲基化基因可恢復其活性。因此，將異常甲基化的抑癌基因或促癌基因去甲基化有可能抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，RASGRF1基因異常甲基化不僅與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，如腦外傷昏迷、癲癇發(fā)作等[19，20]，還可參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。如Klose等[8]研究發(fā)現(xiàn)，RASGRF1基因甲基化異常升高可增加人群罹患胃癌的風險。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織RASGRF1基因甲基化陽性率明顯高于癌旁正常組織；結(jié)腸癌組織RASGRF1基因甲基化陽性與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關(guān)。表明RASGRF1基因甲基化陽性在結(jié)腸癌組織中高表達，其高表達與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

Konstantinopoulos等[32]通過研究證實，SAHA聯(lián)合聚PARP抑制劑對卵巢癌細胞的協(xié)同作用可能與DNA的同源重組相關(guān)。同源重組DNA修復途徑中，成員發(fā)生頻繁的遺傳學和表觀遺傳學改變是漿液性上皮性卵巢癌的特征是，多數(shù)存在不同程度的同源重組修復缺陷。PARP抑制劑是針對同源重組缺陷腫瘤的靶向治療藥物，而對具有完整同源重組途徑的上皮性卵巢癌治療作用差。實驗觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SAHA處理后的巢癌細胞中同源重組途徑的相關(guān)基因RAD51和BRCA1表達下調(diào)，并且在體內(nèi)、體外實驗中都能夠增加PARP抑制劑對于卵巢癌細胞的毒性作用，證實SAHA的抗腫瘤機制與DNA的同源重組關(guān)系密切[32]。

為進一步確定RASGRF1基因甲基化狀態(tài)與其編碼蛋白表達的關(guān)系，本研究分析了結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達與RASGRF1基因甲基化陽性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達與RASGRF1基因甲基化陽性呈負相關(guān)關(guān)系。說明結(jié)腸癌組織RASGRF1基因甲基化異常升高是RASGRF1蛋白表達下降的重要原因。進一步推斷RASGRF1基因去甲基化可能是未來結(jié)腸癌治療的研究方向之一。

綜上所述，結(jié)腸癌組織RASGRF1蛋白低表達、RASGRF1基因甲基化異常升高，二者呈負相關(guān)關(guān)系，且均與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。