張曉玲，艾尼娃兒·巴巴依，王小云

(1 無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇無錫214100；2 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院；3 無錫市第二人民醫(yī)院)

每年全球大約新發(fā)胃癌患者100萬例，死亡約80萬例，是東亞、東歐以及中美洲和南美洲部分地區(qū)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，其組織學(xué)類型主要有腺癌、鱗癌、鱗腺癌、未分化癌，以腺癌最為常見。手術(shù)切除是目前惟一有可能治愈胃癌的手段。胃癌早期采取根治性手術(shù)治療效果較好，術(shù)后5年生存率可達(dá)到90%。但由于早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已屬中晚期并伴有相鄰臟器、淋巴結(jié)的廣泛侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)治療效果不佳，術(shù)后5年生存率較低[2]。分子靶向治療是近年新興的一種治療方法，是在細(xì)胞分子水平上針對已明確的致癌位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，從而精準(zhǔn)殺死靶區(qū)內(nèi)腫瘤細(xì)胞。因此，深入探索胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，對尋找腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的RNA調(diào)控分子，可作為染色質(zhì)修飾因子對靶基因進(jìn)行表觀遺傳學(xué)修飾，從而在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA還參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)過程[3]。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)是2007年由Howard Chang首次發(fā)現(xiàn)的lncRNA，長度約2.2 kb，定位于人染色體12q13.13，由哺乳動物HOXC基因簇轉(zhuǎn)錄而來[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤組織lncRNA HOTAIR異常表達(dá)，且其表達(dá)變化與腫瘤惡性進(jìn)展有關(guān)[5]。母系印記表達(dá)基因3(MEG3)是小鼠母系印記基因Gtl2的人類同系物，是只在母源等位基因上表達(dá)的印記基因，長度約35 kb，定位于人染色體14q32.3，由10個外顯子組成。有研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3低表達(dá)或表達(dá)缺失，恢復(fù)其表達(dá)則能抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[6]。本研究觀察了胃腺癌組織lncRNA HOTAIR、MEG3表達(dá)變化及其臨床意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年5月～2018年10月無錫市中醫(yī)醫(yī)院收治的初診胃腺癌患者142例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合胃腺癌診斷；②接受胃癌切除手術(shù)；③初診，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并嚴(yán)重肝、腎等重要臟器功能不全者；③有精神系統(tǒng)、自身免疫系統(tǒng)疾病者；④臨床病理資料不完整者。其中，男75例、女67例，年齡18～70(59.1±8．7)歲；腫瘤直徑：<5 cm 78例，≥5 cm 64例；腫瘤部位：賁門胃底部26例，胃體部24例，幽門胃竇部92例；組織分化程度：高中分化65例，低未分化77例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期84例，Ⅲ、Ⅳ期58例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78例。本研究經(jīng)無錫市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA HOTAIR、MEG3表達(dá)檢測 采用RT-qPCR法。將手術(shù)切除的胃腺癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm)置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存。取凍存的胃腺癌組織與癌旁正常組織約100 mg，室溫下解凍，采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，按2×SYBR Green PCR Master Mix說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：lncRNA HOTAIR上游引物5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；lncRNA MEG3上游引物5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，下游引物5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′；GAPDH上游引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板2 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，無核酸水7.2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環(huán)。以GAPDH內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌組織與癌旁正常組織lncRNA HOTAIR、MEG3表達(dá)比較 胃腺癌組織與癌旁正常組織lncRNA HOTAIR相對表達(dá)量分別為4.12±0.54、0.32±0.07，lncRNA MEG3相對表達(dá)量分別為0.45±0.13、1.17±0.24。胃腺癌組織lncRNA HOTAIR相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，lncRNA MEG3相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(P均<0.01)。

2.2 胃腺癌組織lncRNA HOTAIR表達(dá)與lncRNA MEG3表達(dá)的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，胃腺癌組織lncRNA HOTAIR相對表達(dá)量與lncRNA MEG3相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.626，P<0.01)。

2.3 胃腺癌組織lncRNA HOTAIR、MEG3表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 胃腺癌組織lncRNA HOTAIR、MEG3相對表達(dá)量均與腫瘤組織分化程度、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

表1 胃腺癌組織lncRNA HOTAIR、MEG3表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

胃癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，每年新發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全世界的42.6%、45.0%[7]。手術(shù)切除是目前惟一有可能治愈胃癌的手段。胃癌早期采取根治性手術(shù)治療效果較好。但多數(shù)患者確診時已屬中晚期，手術(shù)治療效果不佳。分子靶向治療是近年興起的一種治療中晚期胃癌的重要手段，其治療的關(guān)鍵在于靶點(diǎn)定位的準(zhǔn)確性。因此，深入探索胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，從而定位分子治療靶點(diǎn)，對提高治療效果具有重要意義。

近年研究表明，非編碼RNA(ncRNA)可通過影響染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)等影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。根據(jù)核苷酸長度，可將ncRNA分為小RNA(≤200 nt)和lncRNA(>200 nt)。由于lncRNA缺少開放閱讀框架，其外顯子少，表達(dá)水平低于蛋白質(zhì)編碼基因，但其表達(dá)具有較高的組織特異性。在功能上，lncRNA可作為分子支架、分子向?qū)Щ蛉旧|(zhì)修飾因子等對靶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，繼而調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯等。HOTAIR最初是在人成纖維細(xì)胞的HOX基因中被發(fā)現(xiàn)的，是一種具有反式作用的lncRNA，即可通過反式作用沉默染色質(zhì)中基因表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR能與多梳抑制復(fù)合物2相互作用，導(dǎo)致H3K27三甲基化酶(PRC2復(fù)合體)功能喪失，從而抑制下游基因表達(dá)，繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤和遷移等惡性生物學(xué)行為；而在敲除lncRNA HOTAIR表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤和遷移能力均下降[9]。有研究還發(fā)現(xiàn)，胃腸道腫瘤組織lncRNA HOTAIR高表達(dá)者多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移，總體生存時間較短，故lncRNA HOTAIR有可能作為評估患者預(yù)后的分子生物標(biāo)志物[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織lncRNA HOTAIR相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，與以往研究[11，12]結(jié)果一致。表明lncRNA HOTAIR可能參與胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織lncRNA HOTAIR相對表達(dá)量與腫瘤組織分化程度、TNM分期有關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。表明胃腺癌組織lncRNA HOTAIR表達(dá)變化與腫瘤惡性進(jìn)展有關(guān)。目前認(rèn)為，lncRNA HOTAIR可通過5′端結(jié)合EED、EZH形成具有H3K27三甲基化能力的PRC2復(fù)合體，在3′端形成具有H3K4去甲基化能力的LSD1/CoREST/REST復(fù)合體，進(jìn)而對染色質(zhì)進(jìn)行甲基化和去甲基化修飾，影響下游靶基因表達(dá)，如MMPs、PTEN等，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤和遷移[13]。

lncRNA MEG3最早是作為小鼠Gtl2的同源印記基因被發(fā)現(xiàn)的，在垂體和腦組織中表達(dá)較高，而在多種腫瘤組織中低表達(dá)。有研究表明，lncRNA MEG3表達(dá)降低與其編碼基因的差異性甲基化區(qū)域異常甲基化有關(guān)。lncRNA MEG3表達(dá)降低后，腫瘤細(xì)胞的浸潤和遷移能力增強(qiáng)，而通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使lncRNA MEG3過表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制[14]，這表明lncRNA MEG3在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。此外，lncRNA MEG3低表達(dá)者易出現(xiàn)淋巴結(jié)或血行轉(zhuǎn)移，且與患者較短的生存時間有關(guān)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織lncRNA MEG3相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，其原因可能與lncRNA MEG3的高甲基化有關(guān)。lncRNA MEG3定位于14號染色體的DLK1-MEG3印記基因區(qū)域，而DLK1-MEG3區(qū)域在父本等位基因上有兩個關(guān)鍵的甲基化區(qū)域，均位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游[16]，當(dāng)該區(qū)域高甲基化時，lncRNA MEG3表達(dá)降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織lncRNA MEG3相對表達(dá)量與腫瘤組織分化程度、TNM分期有關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。表明lncRNA MEG3亦可參與胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展，與以往文獻(xiàn)[17]報(bào)道一致。lncRNA MEG3可通過RNA-蛋白質(zhì)相互作用直接激活腫瘤抑制因子RB1，或通過激活CDKN4A間接激活RB1，進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[18]。此外，lncRNA MEG3還能通過磷酸化等途徑抑制MDM2表達(dá)，當(dāng)lncRNA MEG3表達(dá)降低時MDM2表達(dá)升高，其與p53蛋白結(jié)合，能夠抑制p53蛋白的反式激活和轉(zhuǎn)錄功能，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織lncRNA HOTAIR相對表達(dá)量與lncRNA MEG3相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其原因尚不完全清楚，可能是lncRNA HOTAIR表達(dá)升高后，與EZH2、EED、SUZ12等因子結(jié)合形成具有甲基化酶功能的復(fù)合物，對染色質(zhì)進(jìn)行表觀遺傳學(xué)修飾，能夠抑制lncRNA MEG3表達(dá)[20]。

綜上所述，胃腺癌組織lncRNA HOTAIR表達(dá)升高、lncRNA MEG3表達(dá)降低，二者均參與胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展。lncRNA HOTAIR、MEG3有可能成為胃腺癌診斷的分子生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。