樊二勤 劉彩霞 付鵬躍 楊傳平 曲冠證

(林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040)

木質(zhì)素是維管植物中的重要大分子物質(zhì)，與纖維素、半纖維素縱橫交錯形成次生細胞壁[1～2]。木質(zhì)素不但對維管運輸和植物機械支撐起重要作用，而且在植物對環(huán)境適應及抵抗生物和非生物脅迫過程中發(fā)揮作用[3～8]。木質(zhì)素作為木材的主要組成成分，在林木的生長發(fā)育過程中具有非常重要的作用。木質(zhì)素是復雜的苯丙烷類單體聚合物，通常是由3種單體聚合而成，3種單體分別為p-coumaryl(H型，20)，coniferyl(G型，22)和sinapyl(S型，24)alcohols(圖1)。在雙子葉植物中，木質(zhì)素主要是由S型，G型和少量的H型以及其它中間的代謝產(chǎn)物聚合而成[9]。在楊樹中，S型和G型木質(zhì)素單體比值大約為2∶1[10]。

圖1 楊樹中各種酶參與的木質(zhì)素單體的合成途徑Fig.1 Synthetic pathway of lignin monomer involved in various enzymes in poplar

木質(zhì)素是苯丙烷代謝途徑的重要產(chǎn)物之一，在生物合成中涉及到許多重要的酶參與。其中對-香豆酸3-羥化酶(p-coumarate 3-hydroxylase,C3H)屬于細胞色素P450單氧化酶，是在對-香豆酰輔酶A(p-coumaroyl CoA)到咖啡酰輔酶A(caffeoyl CoA)的羥基化過程和G/S單體形成中的關鍵控制酶類[11]。2001年Schoch和Franke等從擬南芥中分離并定位到C3H基因，證明C3H有可能是木質(zhì)素合成中重要的中間代謝物質(zhì)[12～13]；Abdulrazzak等人又獲得擬南芥突變體，其生長發(fā)育受到抑制，木質(zhì)素組成也與REF8基因突變體相似，進一步證明了CYP98A3為編碼C3H的基因。

一直以來，國內(nèi)外對C3H作為關鍵的木質(zhì)素合成調(diào)控酶的研究集中在草本植物和裸子植物上，主要是提高紙漿獲得率及飼料消化率[14～18]，而對于林木中的C3H研究甚少，為探究其在楊樹中的表達模式，本文以84K楊為研究對象，通過探究PagC3H3基因在84K楊不同組織中的特異性表達來解析該基因的表達模式；再者，啟動子是調(diào)控基因表達的重要組成部分，克隆啟動子序列是了解基因表達模式及調(diào)控機制的關鍵，目前對楊樹中C3H基因啟動子的功能研究報道較少，本文根據(jù)已公布的楊樹基因組，從84K楊中克隆PagC3H3基因的啟動子序列，構建到植物表達載體上，瞬時侵染擬南芥，GUS染色表明該啟動子具有時空特異性表達的特征，同時表明該啟動子調(diào)控PagC3H3基因在木質(zhì)素合成中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生型擬南芥(ArabidopsisthalianaCol-0)和84K楊(Populusalba×P.grandulos)均為本實驗室保存。

1.2 菌株及主要試劑

大腸桿菌(Esherichiacoli)Trans1-T1感受態(tài)購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態(tài)購自上海唯地生物技術有限公司；pBI121載體由本實驗保存；pEASY-T1 Clonging Vector購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自杭州博日科技(Bioer)有限公司；RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(BioTeke)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑、限制性內(nèi)切酶、LATaq酶、dNTP Mixture、DNA Ligation Kit、DNA Marker等均購自TaKaRa公司(大連)；其他實驗試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 84K楊PagC3H3基因組織特異性表達分析

為了檢測84K楊PagC3H3基因在不同組織的表達水平，選取溫室內(nèi)長勢基本一致，株高為1.2 m的3株五月齡84K楊，分別取頂芽、頂部莖節(jié)、中部莖節(jié)、基部莖節(jié)、幼葉、功能葉、根7個組織部位。利用BioTeke公司通用植物總RNA提取試劑盒對84K楊不同組織的Total RNA進行提取，操作方法參照試劑盒說明書。利用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將質(zhì)量完好的84K楊不同組織的Total RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋5倍作為定量PCR檢測的模板，以毛果楊Ptractin基因作為內(nèi)參基因，引物序列如下：Ptractin-RT-F(5′-AATACCCCATTGAGCACGG-3′)/Ptractin-RT-R(5′-ACTCACACCATCACCAGAATC-3′)，檢測目的基因在不同組織的表達量，所用的定量PCR引物為：PagC3H3-RT-F(5′-TCAGGCTACTTCCATTTGGTG-3′)/PagC3H3-RT-R(5′-AATTTCCTCTGGCTTCACTCC-3′)。反應程序按照機器(Applied Biosystems 7500)設置進行，反應完成后，將定量PCR數(shù)據(jù)導出，利用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達量。

1.3.2 84K楊PagC3H3啟動子的克隆

根據(jù)Phytozome網(wǎng)站上公布的毛果楊基因組信息，查找PtrC3H3基因上游的啟動子序列，設計特異性引物，引物序列如下：PagC3H3-pro-F(5′-ATCAAGCTTCGTGTCAATTTATTCAACATTCTTAC-ACACAC-3′)/PagC3H3-pro-R(5′-ATCTCTAGATGTGGAGAGAAAAAATAAAAATTGGAAGAGAAAG-GG-3′)。以84K楊組培苗葉片為DNA提取的材料，利用本實驗室改良的CTAB法[19]提取84K楊基因組DNA，根據(jù)設計好的引物進行目的片段的擴增，PCR程序結束后將PCR產(chǎn)物全部進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用膠回收試劑盒對目的條帶進行切膠回收，并根據(jù)操作手冊將純化后的片段連入pEASY-T1載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)，對獲得的單克隆進行PCR檢測，獲得條帶大小與目標一致的陽性克隆，并送至擎科生物公司進行測序檢測，將測序檢測正確的陽性克隆命名為pEASY-PagC3H3-promoter。

1.3.3 pBI121-PagC3H3pro::GUS載體構建及瞬時轉(zhuǎn)化

將測序正確的單克隆，在液體LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，利用Bioer公司的質(zhì)粒提取試劑盒分別對pEASY-PagC3H3-promoter和pBI121這兩種載體進行質(zhì)粒提取，利用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XbaⅠ進行雙酶切，并分別膠回收目的片段，利用TaKaRa公司的DNA Ligation Kit連接酶進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)，對獲得的單克隆進行PCR檢測，獲得條帶大小與目標一致的陽性克隆，并送至擎科生物公司進行測序檢測，將陽性克隆命名為pBI121-PagC3H3pro::GUS。選取測序驗證正確的菌液提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，并對轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌長出的單克隆進行PCR驗證。

瞬時轉(zhuǎn)化方法過程如下：培養(yǎng)2周齡的擬南芥幼苗放到OD600=0.3且含有1/2MS、40 μmol·L-1AS、0.002 mg·L-1TDZ的農(nóng)桿菌侵染液中，于28℃，180 r·min-1搖床中共培養(yǎng)2 d[20]。

瞬時轉(zhuǎn)化擬南芥的組織特異性觀察：對2 d后的擬南芥進行GUS染色觀察，具體步驟如下：將瞬時轉(zhuǎn)化完成后的擬南芥轉(zhuǎn)移到GUS染液中，避光，抽真空處理，使其中的氣體全部溢出，置于37℃水浴鍋中過夜溫育，次日將染色的材料放于卡諾固定液中脫色，期間及時更換固定液，最后將脫色的材料放入培養(yǎng)皿中，通過實體顯微鏡觀察GUS染色情況，并分析該啟動子的組織表達特異性。

2 結果與分析

2.1 PagC3H3在84K楊不同組織表達分析

為了探究PagC3H3基因在84K楊不同組織中的表達特異性，分別提取同一植株的頂芽、頂部莖節(jié)、中部莖節(jié)、基部莖節(jié)、幼葉、功能葉、根等組織的Total RNA，利用qRT-PCR檢測PagC3H3的基因的表達水平，同時以Ptractin基因作為內(nèi)參，結果如圖2所示，表明PagC3H3基因在不同組織中均有表達，且在根、中部莖節(jié)和基部莖節(jié)中表達量較高，在頂芽、頂部莖節(jié)、幼葉和功能葉中表達量較低，上述結果表明PagC3H3基因在木質(zhì)化程度高的組織中高表達。

2.2 PagC3H3基因啟動子序列克隆及分析

提取84K楊葉片DNA作為模板，根據(jù)設計的啟動子引物進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，條帶大小與預期目標一致(圖3A)，切膠回收連接pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)，對單克隆進行PCR檢測(圖3B)，將獲得的陽性克隆命名為pEASY-PagC3H3-promoter，并送至擎科生物公司測序，測序結果表明上述目的片段是84K楊PagC3H3基因上游的啟動子序列。利用PlantCARE在線軟件對PagC3H3啟動子的順式作用元件進行預測分析，在上游啟動子區(qū)域長2 035 bp(圖4)范圍內(nèi)含有多種順式作用元件，涉及多個生物學功能，具體包括以下幾類(表1)：光響應元件、脫落酸響應元件、啟動子和增強子作用元件、核心啟動子元件、分生組織響應元件、厭氧誘導響應元件及MEJA反應響應元件。

圖2 PagC3H3在84K楊不同組織表達分析Fig.2 Expression analysis of PagC3H3 in different tissues of P.alba×P.grandulos

圖3 pEASY-PagC3H3-promoter載體的構建A.PagC3H3啟動子的克?。篗. DNA marker DL5000；1. PagC3H3啟動子的PCR擴增產(chǎn)物 B. pEASY-PagC3H3-promoter載體在大腸桿菌菌液中的PCR檢測：M. DNA marker DL5000；1～3. pEASY-PagC3H3-promoter菌液PCR檢測Fig.3 The construction of pEASY-PagC3H3-promoter vector A. The cloning of PagC3H3 promoter: M. DNA marker DL5000; 1. PCR amplification product of PagC3H3 promoter B. PCR detection of pEASY-PagC3H3-promoter vector in E.coli: M. DNA marker DL5000; 1-3. PCR detection of pEASY-PagC3H3-promoter vector

圖4 84K楊PagC3H3啟動子序列Fig.4 Sequence of the PagC3H3 promoter in P.alba×P.grandulos

圖5 pBI121載體圖譜Fig.5 pBI121 vector map

2.3 pBI121-PagC3H3pro::GUS載體構建

植物表達載體pBI121含有GUS融合蛋白系統(tǒng)，參照載體圖譜(圖5)，將PagC3H3啟動子序列連接到pBI121上，構建表達載體pBI121-PagC3H3pro::GUS。利用HindⅢ和XbaⅠ這兩種限制性內(nèi)切酶分別對pBI121和pEASY-PagC3H3-promoter質(zhì)粒進行雙酶切，將目的片段進行切膠回收，通過DNA Ligation Kit連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)(Trans1-T1)，隨機挑取單克隆進行PCR檢測(圖6A)，獲得條帶大小與目標一致的陽性克隆，將其菌液送至擎科生物公司測序。

選取測序正確的菌液進行質(zhì)粒提取，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，隨機挑取單克隆進行PCR檢測(圖6B)， 結果顯示單克隆均為陽性并命名為GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS，該結果表明植物表達載體構建完成。

表1 PagC3H3啟動子順式作用元件列表

圖6 pBI121-PagC3H3pro::GUS植物表達載體的構建 A. pBI121-PagC3H3pro::GUS載體在大腸桿菌菌液中的PCR檢測：M. DNA marker DL5000；1～6.pBI121-PagC3H3pro::GUS菌液PCR檢測；7.陰性對照 B. pBI121-PagC3H3pro::GUS載體在農(nóng)桿菌(GV3101)菌液中的PCR檢測：M. DNA marker DL5000；1-8. GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS菌液PCR檢測；9.陰性對照Fig.6 The construction of pBI121-PagC3H3pro::GUS plant expression vector A. PCR detection of pBI121-PagC3H3pro::GUS vector in E.coli; M. DNA marker DL5000; 1-6. PCR detection of pBI121-PagC3H3pro::GUS; 7. Negative control B. PCR detection of pBI121-PagC3H3pro::GUS vector in Agrobacterium tumefaciens(GV3101): M. DNA Marker DL5000; 1-8. PCR detection of GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS; 9. Negative control

2.4 擬南芥瞬時轉(zhuǎn)化及GUS活性檢測

將兩周齡的擬南芥幼苗浸泡在GV3101-pBI121-PagC3H3pro::GUS的農(nóng)桿菌菌液中，進行瞬時轉(zhuǎn)化，經(jīng)GUS染色，脫色處理后，在實體顯微鏡下觀察GUS活性，結果如圖7所示，在下胚軸和根中GUS活性較強。推測84K楊PagC3H3啟動子調(diào)控下游基因在木質(zhì)化程度高的組織中強烈表達。

圖7 PagC3H3啟動子驅(qū)動GUS在擬南芥中的GUS染色Fig.7 GUS staining driven by the PagC3H3 promoter in Arabidopsis

3 討論

木材是制漿造紙、房屋建造以及家具制作的重要原料，在社會生產(chǎn)中扮演著一個不可或缺的角色，因此培育出適合于林業(yè)相關產(chǎn)業(yè)加工與利用的優(yōu)良林木品種是林木工作者的重要目標。木材的纖維素與木質(zhì)素含量是影響木材加工與利用的重要因素，木質(zhì)素作為植物體內(nèi)僅次于纖維素的一類重要高分子化合物，不僅具有重要的生物學功能，還是一種重要的能源物質(zhì)。如在造紙生產(chǎn)中，高木質(zhì)素含量就是影響紙漿產(chǎn)量和紙張質(zhì)量的不利因素之一，此外木材中的Guaiacyl型木質(zhì)素(G-木質(zhì)素)由于更難以加工會降低紙漿的產(chǎn)率[21]。

對Guaiacyl型木質(zhì)素(G-木質(zhì)素)、Syringyl型木質(zhì)素(S-木質(zhì)素)合成的關鍵基因C3H3的研究，有助于了解該基因在調(diào)節(jié)木材中3種木質(zhì)素單體的含量、組成及結構等方面發(fā)揮的重要作用，有研究表明：當coumarate 3-hydroxylase(C3H)在雜交楊中被降低后，木質(zhì)素含量降低，并且H型木質(zhì)素增加以及S/G型木質(zhì)素的比值上升[22]。

啟動子是RNA聚合酶識別、結合和開始轉(zhuǎn)錄的位于基因上游的一段DNA序列。植物啟動子通常包含TATA框、CAAT框和GC框，同時該區(qū)域還存在各種控制元件[23]，通過RNA聚合酶的識別、結合，誘導轉(zhuǎn)錄過程，從而在植物基因表達調(diào)控過程中起到重要作用[24～25]。啟動子決定基因表達的時空特異性，可以為分析基因調(diào)控提供重要信息。由此通過研究啟動子的特性，用于分析下游基因的表達特異性，有助于了解植物生長發(fā)育的過程及對外界環(huán)境的適應情況，從而能夠更好的控制外源基因高效、穩(wěn)定、長期的在目的部位表達。

本實驗以廣泛被應用的用材樹種84K楊為研究對象，初步探究了84K楊PagC3H3基因的表達模式，對PagC3H3基因在84K楊不同組織中的特異性表達進行了分析，并對PagC3H3啟動子進行了克隆及功能驗證，證明了PagC3H3基因在木質(zhì)化程度高的部位表達量高，也表明該啟動子存在時空特異性表達的特征，由此推測該基因的表達模式為在木質(zhì)化程度高的組織中高表達，暗示該基因在木質(zhì)素合成過程中發(fā)揮作用。該研究對于PagC3H3基因功能的解析，涉及較少，例如該基因在調(diào)控木質(zhì)素合成過程中是如何影響木材形成中的生長性狀，如何利用該基因在木質(zhì)素合成中發(fā)揮的作用來調(diào)節(jié)木質(zhì)素的合成量及結構(木質(zhì)素單體S/G比例)，從而對84K楊木材的工業(yè)化應用提供理論依據(jù)；其次，林木中C3H3啟動子是如何準確調(diào)控C3H3基因在木質(zhì)素合成中行使功能，還有待進一步的探究，期待在林木中對C3H3基因的功能做出更詳細的闡述。