劉靜，郭章，李景，沈宋利

（1.紹興文理學院，浙江紹興 312000；2.杭州伊美源檢測科技有限公司，浙江杭州 310030；3.浙江鼎清環(huán)境檢測技術有限公司，浙江杭州 310030；4.浙江聚光檢測技術服務有限公司，浙江杭州 310053）

MT(金屬硫蛋白基因，Metallothionein)是一種天然生物活性的物質(zhì)，廣泛存在于生物體內(nèi)，能被金屬離子、氧化損傷及免疫刺激等多種因素誘導產(chǎn)生，具有參與細胞內(nèi)金屬水平的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、清除重金屬解毒自由基等重要生物學功能。

近年來，國內(nèi)外學者對金屬蛋白進行了廣泛的研究，并已深入到基因水平。分子生物學技術的快速發(fā)展，使MT克隆技術、RNA印跡技術和PCR技術應用于MT的定量檢測成為現(xiàn)實。MT克隆檢測是通過MT多克隆和單克隆抗體，運用免疫擴散、免疫電泳等方法來對組織中的MT-mRNA含量進行定量分析，這在生物學研究中有重要的意義。然而目前還缺乏一種簡便、靈敏、快捷適宜產(chǎn)業(yè)化的分離純化和檢測技術，這也成為MT研究的熱點。

金屬硫蛋白一個顯著的特點就是能在轉錄水平上被環(huán)境中的金屬所誘導，外界環(huán)境穩(wěn)定時，MT在動物體內(nèi)的表達是穩(wěn)定的，當外界或者體內(nèi)金屬元素的含量超過一定濃度時，將誘導MT的表達，表達水平的高低與環(huán)境中的金屬濃度有直接的關系[1]。目前普遍認為，金屬硫蛋白主要的生理功能是穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)細胞內(nèi)金屬水平，即參與生物體內(nèi)必需金屬元素的調(diào)節(jié)和非必需金屬元素的解毒[2]。

1 材料

1.1 實驗動物

田螺，取自紹興文理學院實驗基地。

1.2 主要儀器設備

上海鼎科SW-CJ-1D垂直潔凈工作臺、美國賽洛捷克高速微量冷凍離心機D3024R、MASTER LOCK微型離心機Mini-6K、尚儀電熱恒溫鼓風干燥箱XGQ2000、icers藥品冷藏箱、上海博訊立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋BXM-30R、常州國華數(shù)顯恒溫水浴箱HH-8、上海嘉鵬全自動凝膠成像分析系統(tǒng)ZF-288、馳唐暗箱紫外分析儀WFH-203C、Eppendorf基因擴增儀 Mastercycler X50、上海天能穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀EPS200。

1.3 主要試劑及藥品

無水乙醇，糖原，1.5 mL Eppendorf管（RNase-free），Tips（RNase-free）[α-32P]dCTP（＞ 400 Ci/mmol），50 mmol/L、200 mmol/L EDTA，TE- 飽和酚∶氯仿（1 ∶ 1），7.5 mol/L NH4Ac，100%、70% 乙醇，TE緩沖液、蛋白胨、NaCl、氯仿、瓊脂、異戊醇等為國產(chǎn)分析純；pMD19T載體、DNA Marker購自Takara公司；dNTPs、rizol試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA抽提試劑盒購自碧云天公司；DH5α、氨芐、X-Gal、青霉素、IPTG、EB等。

2 實驗方法

2.1 準備工作

（1）塑料制品的處理。將DEPC加入裝有離子水的玻璃燒杯中，制備為濃度0.1%的DEPC溶液。將待處理的塑料制品放入高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液至塑料制品全部浸泡。通風室溫處理過夜?；厥諒U液，用錫箔紙封口或包裹塑料制品，滅菌，烘干備用。

（2）玻璃和金屬物品。用錫箔紙封口或包裹，250 ℃烘烤 3 h 以上。

（3）采取0.002 μmol/L氯化鑭刺激田螺，取經(jīng)鑭刺激的鰓組織。

2.2 田螺RNA的提取

采用Trizol法提取田螺RNA。

（1）液氮研磨，將田螺鰓組織塊直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，如此3次，每50～100mg組織加入1ml Trizol，轉入離心管進行第（2）步操作；

（2）勻漿:組織體積不能超過Trizol體積的10%，否則勻漿效果會不好，用電動勻漿器充分勻漿需 1 ～ 2 min；

（3）細胞或組織加Trizol后，室溫放置5 min，使其充分裂解?？煞湃?70 ℃長期保存；

（4）12 000 g 離心 5 min，棄沉淀；

（5）根據(jù) Trizol的體積，每 1 mL Trizol中加入200 μL氯仿，振蕩混勻后室溫放置15 min。注:禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂；

（6）4℃ 12 000 g 離心 15 min；

（7）吸取上層水相，至另一離心管中。棄下層酚相；

（8）按每1 mL Trizol中加入0.5 mL異丙醇混勻，室溫放置 5～ 10 min；

（9）4℃ 12 000g離心 10 min，棄上清，RNA 沉于管底；

（10）按75%乙醇∶Trizol=1∶1比例加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；

（11）4 ℃ 8 000 g 離心 5min，盡量棄上清；（12）室溫晾干或真空干燥5～10 min；

（13）可 用 50 μL H2O、TE buffer或 0.5%SDS溶解 RNA樣品，55～ 60 ℃，5～ 10 min。注:H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓；

（14）測O.D值定量RNA濃度。

2.3 MT基因克隆與鑒定

2.3.1 總RNA的檢測

取3 μL的RNA樣品和1 μL溴酚藍Buffer混合，用1.0%普通瓊脂糖凝膠電泳在100 V電壓下電泳10 min，電泳結果用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

2.3.2 反轉錄

（1）滅菌離心管冰浴備用；

（2）將目的RNA和對照RNA冰浴融化；

（3）按順序依次加入RNA 2.0 μL、引物dT17 1.0 μL、DEPC 水 2.0 μL；

（4）混勻后，分別將離心管于70 ℃水浴中保溫5 min，再冰浴 5 min；

（5）在另一個離心管中依次加入DEPC 水 8.5 μL、5×RT Buffer 4.0 μL、dNTPs 1.0 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、M-MLV RTase H 1.0 μL 試劑混勻并冰?。?/p>

（6）將上述按每個反應15 μL準備的反應混合液，加入含5 μL先前配制的RNA模板和引物混合物的離心管中；

（7）模板和引物退火:將反應管置于25 ℃保溫5 min；

（8）cDNA鏈合成:將反應管置于42 ℃保溫1 h；（9）直接取用或冷凍保存。

2.3.3 PCR反應

將反轉錄得到的cDNA作為模板進行PCR擴增反應，基因的特異性引物為MTf:5’-ATGGCATCTCAAGTGTGTGC-3’；MTr:5’-CTATCACTCGAGGTCAGTGT-3’。

PCR 結束后 4 ℃保存，再取出近 8 μL PCR 擴增液擴增產(chǎn)物用2.0%普通瓊脂糖凝膠電泳在90 V電壓下電泳10 min，EB溶液染色15～20 min，電泳結果用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

2.3.4 PCR產(chǎn)物的回收與克隆鑒定

（1）挑取大腸桿菌 DH5α 單菌落，接于 5 ml LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜；

（2）以1∶50比例將1 mL菌液轉移到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1.5～2 h；

（3）將4 mL培養(yǎng)液轉移到5 mL離心管中，4 ℃下，5000 rmp 離心 3 min；

（4）棄上清，加 0.5 mL 預冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液，輕輕吹打或搖動以混勻細胞（勿劇烈振蕩）；

（5）冰浴15～20min，4℃，5000 rmp離心2min；

（6）棄上清，加 0.1 mL 預冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液，輕輕吹打或搖動混勻細胞，即得感受態(tài)細胞；

（7）取0.1 mL感受態(tài)細胞轉移到1.5 mL離心管中，加 1 μL 質(zhì)粒，混勻，冰上放置 30 min；

（8）42 ℃水浴 60 s，冰浴 2 min；加入 0.8 mL 新鮮 LB 培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min 振蕩約 1 h；

（9）取200 μL涂布到含有氨芐青霉素的平板上，37 ℃倒置培養(yǎng) 12 h。

2.3.5 測序鑒定

挑取陽性克隆，擴大培養(yǎng)后測序。所得測序結果提交GenBank比對，辨別是否為所需的田螺MT基因片段。

3 結果與分析

3.1 田螺的RNA提取

總RNA提取如圖1所示，說明RNA的完整性較好。

3.2 田螺MT的PCR擴增

對總RNA反轉錄所得到的cDNA進行PCR擴增，擴增出的條帶在250 bp左右，即目的基因所在條帶。結果見圖2。

圖2 MT的PCR擴增產(chǎn)物

3.3 MT基因的測序比對

經(jīng)測序和提交Genbank比對，上述PCR擴增產(chǎn)物的序列均為MT序列，并且100%相同，表明分別從cDNA和DNA中擴增出了田螺的MT序列，兩者序列完成一致，證明田螺MT基因不含有內(nèi)含子，因此鑭處理不影響MT基因的轉錄。

4 討論

MT是一類富含半胱氨酸和金屬離子的、具有基因多態(tài)性的小分子蛋白質(zhì)，廣泛表達于所有真核細胞和部分原核細胞的胞漿中。在應激等條件下，MT也可以被釋放到細胞外來發(fā)揮作用[3]，具有廣泛的生物學功能，是科技界在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種生理功能很多的活性物質(zhì)。，由于MT分子中含有20個游離的巰基（-SH）基因以及由它們組成的多個巰基簇，因此在提高生物體的健康生長、增強抵抗力、增強免疫力等方面具有十分重要的作用。金屬硫蛋白具有很強的金屬結合能力和氧化還原能力，在生物體內(nèi)參與細胞內(nèi)金屬水平的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、自由基清除、重金屬解毒等，具有重要的生物學功能[4].因此MT基因的結構及表達的調(diào)控是目前生物醫(yī)學領域的一個研究熱點。

MT具有很大的開發(fā)潛力和無法估量的應用價值，隨著人們對MT研究的不斷深入，對MT作用機理的不斷探明，MT的應用也將越來越廣泛。MT功能獨特，近年來對MT的研究日益受到重視。不僅對MT的分子結構、性質(zhì)、參與體內(nèi)微量元素代謝、解除重金屬的毒性、清除體內(nèi)自由基、抗氧化損傷、防止機體衰老、應激能力等生物學功能進行了闡述，并對MT與腫瘤和其他疾病的關系等方面的研究進行了綜述，并提出了MT研究中存在的問題及展望。MT作為模型系統(tǒng)，還可在基因工程和基因表達調(diào)控方面發(fā)揮巨大的效益，可從MT的代謝方面、生理機能上、結構上和在養(yǎng)殖業(yè)中的應用，挖掘出金屬硫蛋白在養(yǎng)殖方向上的應用前景。