棉花PsbS基因?qū)煵莨夂咸匦缘挠绊?/h1>
2019-07-18 00:53:26曾曉燕趙瑞海李志博魏亦農(nóng)
新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年4期
曾曉燕，趙瑞海，李志博，魏亦農(nóng)
(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)
0 引 言
【研究意義】高等植物具有光保護(hù)機(jī)制，可以減輕光帶來的有害影響，非光化學(xué)猝滅(NPQ)是光保護(hù)機(jī)制之一[1]，PsbS被認(rèn)為僅存在于高等植物中，通過與天線蛋白的相互作用來激活NPQ[2]，研究PsbS基因在光系統(tǒng)II中的功能對今后選育高光效棉花品種具有現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究表明，通過表達(dá)調(diào)節(jié)QA氧化還原狀態(tài)，影響氣孔導(dǎo)度和葉片的水分利用效率[3]；過量表達(dá)PePsbS1和PePsbS2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物均顯示出增強(qiáng)的光保護(hù)作用，而且PePsbS1和PePsbS2的表達(dá)還可以恢復(fù)擬南芥npq4突變體的NPQ[4]。已經(jīng)對該基因在棉花中進(jìn)行了克隆和功能初步分析[5]，該基因能響應(yīng)多種脅迫及不同的光照處理?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】該基因相關(guān)研究主要集中在熒光特性方面，而光合方面研究則相對較少。研究比較煙草中過量表達(dá)PsbS株系與野生型的表型差異。【擬解決關(guān)鍵問題】比較煙草中過量表達(dá)PsbS株系與野生型的光合相關(guān)參數(shù)，研究棉花PsbS基因在光保護(hù)中作用機(jī)制。對PsbS基因在棉花中的具體功能進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。
1 材料與方法
1.1 材 料
試驗(yàn)三個(gè)純系(3個(gè)純合株系L1、L2、L3)已克隆完成的過表達(dá)載體pGWB17-GhPsbS，及已轉(zhuǎn)化完成的T2代過量表達(dá)PsbS煙草、普通野生型煙草(WT)，種植在新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室。
1.2 方 法
1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
選擇三個(gè)煙草株系L1、L2、L3種子均勻點(diǎn)播在1/2 MS培養(yǎng)基中。25～30 d，采用盆栽試驗(yàn)，將幼苗移栽入花盆中，以基質(zhì)和蛭石按3∶1比例混合裝入直徑為15 cm、高12 cm 的花盆，每盆移栽一株，轉(zhuǎn)基因煙草(3個(gè)純合株系L1、L2、L3)與野生型煙草各移種9盆，放入人工氣候室生長，定期澆適量的水，人工氣候室光照為240 μmol/(m2·s)，溫度為20℃。
生長期間不定期測量各株系的葉面積；當(dāng)?shù)?片葉完全展開時(shí)，取樣測葉綠素含量；在光照培養(yǎng)箱進(jìn)行不同光強(qiáng)處理：75(較低光強(qiáng))、240 (正常光強(qiáng))、450 μmol/(m2·s)(較高光強(qiáng))，4 h后采用LI-6400 型便攜式光合系統(tǒng)儀(美國Li-cor公司)測量各株系間的光合特性。
1.2.2 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定
根據(jù)改良的CTAB法提取抗性植株的葉片DNA[6]，設(shè)計(jì)PsbS特異引物F：5'-CACCATGGCTCAAACAATGCTGGTAAT-3'，R：5'-GTCTTCTTCCGCTTCAT
CAGTAAC-3' (由上海捷瑞生物工程有限公司合成)。利用該對引物，以提取的煙草DNA為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。其條件為 94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；16℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下檢測PCR產(chǎn)物，驗(yàn)證為陽性植株的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.3 葉面積測定
不同生長時(shí)期用長寬法測定煙草葉片葉面積[7]，計(jì)算葉面積(葉面積/cm2=0.707 5×長×寬)，轉(zhuǎn)基因3個(gè)株系與野生型各隨意選取5株，每株選擇最大葉長寬。
1.2.4 葉綠素( Chl) 及類胡蘿卜素含量測定
參考張蜀秋等[8]的方法并有所改進(jìn)，采用直接浸提法，避開葉脈取葉片圓片用80%的丙酮溶液提取(葉片1.1 cm打孔器4片稱重+13 mL丙酮溶液)，試管用黑布遮住置于黑暗室溫條件下放置72 h，期間搖動(dòng)數(shù)次至各綠色器官圓片呈白色時(shí)，取其上清液用U-5100 UV/VIS 型分光光度計(jì)(日本)于663、645和470 nm波長下比色，用80%丙酮作空白對照。每個(gè)株系及野生型煙草取5株的平均值為測定值。計(jì)算出提取液中葉綠素a和葉綠素b的含量，葉綠素含量計(jì)算公式如下(Lichtenthaler，1983)：
葉綠素a的含量(mg/g)= (12.21D663-2.81D646)×V/W.
葉綠素b的含量(mg/g)= (20.13D646-5.03D663)×V/W.
類胡蘿卜含量(mg/g)=(1 000D470 - 3.27C(Chla)- 104C(Chlb))/229.
式中D663、D645、D470 分別為相應(yīng)波長下的光密度值，V為提取液體積，W為所取葉片鮮重。
1.2.5 光合特性測定
人工氣候箱溫度設(shè)為28℃，濕度為37%，75、240、450 μmol/(m2·s)三個(gè)光強(qiáng)下轉(zhuǎn)基因株系各3株，野生型3株。儀器使用開放式氣路，內(nèi)置光源，測定轉(zhuǎn)基因各植株凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)等指標(biāo)。測定時(shí)選擇植株相同葉片，選取大致相同的部位，最后取各株系的平均值與野生型進(jìn)行比較。
1.3 數(shù)據(jù)處理
原始數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 軟件，分別計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，并繪制圖表。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0 進(jìn)行顯著性分析，圖中小寫字母和“*”表示轉(zhuǎn)基因與野生型煙草在P< 0.05水平上差異顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得
分別提取野生型和抗性株系的 DNA，以PsbS基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在轉(zhuǎn)化株系中都分別擴(kuò)增出預(yù)期目的條帶，在野生型煙草植株中未擴(kuò)增出目的條帶，已驗(yàn)證植株為轉(zhuǎn)基因的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖1
注：M：Marker；1～3：轉(zhuǎn)PsbS基因植株；4：WT；5：陰性對照；6：陽性對照
Note: M:Marker; 1-3: transgenic PsbS gene plants; 4: WT; 5: negative control; 6: positive control
圖1 轉(zhuǎn)PsbS基因煙草鑒定
Fig. 1 Identification of transgenic PsbS tobacco
2.2 葉面積差異
研究表明，轉(zhuǎn)PsbS基因煙草生長前期的葉片增長幅度明顯比野生型煙草葉片增長的快。從移栽入土中開始，19～30 d，轉(zhuǎn)基因3個(gè)株系與野生型均差異顯著。第19 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的平均葉面積是普通野生型的2.36倍，22 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的葉面積是普通野生型的2.39倍，而到第30 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的葉面積是普通野生型的1.66倍。移栽前期轉(zhuǎn)PsbS基因煙草明顯較野生型生長較快，30 d時(shí)增長幅度已呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。圖2
與野生型相比，轉(zhuǎn)PsbS基因的煙草前期葉片明顯偏大，而到40 d左右差異逐漸減小。該基因在某種程度上促進(jìn)了煙草葉片前期的快速生長。圖3
圖2 轉(zhuǎn)PsbS基因煙草與野生型煙草不同時(shí)期葉面積比較
Fig. 2 Comparison of Leaf Areas between TransgenicPsbSGene and Wild Type Tobacco in Different Periods
圖3 轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草生長狀況
Fig. 3 Growth status of transgenic tobacco and wild type tobacco
2.3 轉(zhuǎn)PsbS基因煙草株系葉綠素及類胡蘿卜素含量
研究表明，轉(zhuǎn)基因株系L3的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量與普通野生型差異都極顯著，L3的葉綠素a和葉綠素b含量分別是普通野生型的1.39倍和1.62倍，且其類胡蘿卜素含量比普通野生型高了37%，L1和L3的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量與普通野生型雖沒有太大差異，但均高于普通野生型。而葉綠素a/b含量有所不同，普通野生型的含量顯著高于轉(zhuǎn)基因兩個(gè)株系。轉(zhuǎn)PsbS基因能夠提高煙草的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。圖4
注：A:葉綠素a; B:葉綠素b; C:類胡蘿卜素; D:葉綠素a/b
Note: A: chlorophyll a; B: chlorophyll b; C: carotenoid; D: chlorophyll a/b
圖4 轉(zhuǎn)基因煙草株系葉綠素和類胡蘿卜素含量
Fig. 4 The strain of transgenic tobacco chlorophyll and Carotenoid content
圖5 轉(zhuǎn)基因煙草各株系不同光強(qiáng)下的凈光合速率
Fig. 5 Net photosynthetic rate of different lines of transgenic tobacco under different light intensities
2.4 轉(zhuǎn)PsbS基因煙草的光合特性
2.4.1 凈光合速率(Pn)的影響
研究表明，三個(gè)株系(L1、L2、L3)與野生型(普通野生型)間差異顯著；在與生長光照相同的240 μmol/(m2·s) 光照處理后，三個(gè)株系均與普通野生型存在顯著差異，株系L3的光合速率是普通野生型的3倍，而株系L1、L2的凈光合速率則是普通野生型的2倍，同時(shí)轉(zhuǎn)基因株系間也存在差異；低光強(qiáng)75 μmol/(m2·s)下光合速率雖然都有所下降，但轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率還是高于野生型的光合速率，較高光強(qiáng)450 μmol/(m2·s)下L1、L2轉(zhuǎn)基因株系的光合速率比240 μmol/(m2·s)明顯有所升高。
2.4.2 氣孔導(dǎo)度(Gs)的影響
轉(zhuǎn)基因株系L3在240 、450 μmol/(m2·s)光強(qiáng)下的氣孔導(dǎo)度與野生型間差異顯著，分別是普通野生型的2.26、1.46倍；雖然株系L1、L2在三個(gè)光強(qiáng)處理下與野生型間無差異，但轉(zhuǎn)基因三個(gè)株系在不同光強(qiáng)下氣孔導(dǎo)度均略高于野生型煙草的氣孔導(dǎo)度。圖6
圖6 轉(zhuǎn)基因煙草各株系在不同光強(qiáng)下的氣孔導(dǎo)度
Fig. 6 Stomatal conductance of transgenic tobacco lines under different light intensities
2.4.3 胞間CO2濃度(Ci)的影響
研究表明，不同光強(qiáng)處理后，野生型普通野生型的胞間CO2濃度明顯比轉(zhuǎn)基因株系的Ci高，但二者間的胞間CO2濃度無顯著差異。當(dāng)處理光強(qiáng)為75 μmol/(m2·s)時(shí)，只有轉(zhuǎn)基因株系L2與普通野生型差異顯著，且普通野生型的Ci是株系L2的1.3倍，分別比L1、L3高了15%、18%；而與生長光強(qiáng)一致的240 μmol/(m2·s)和較高光強(qiáng)(450 μmol/(m2·s))處理后，轉(zhuǎn)基因各株系與普通野生型間雖無顯著差異，普通野生型的Ci高于轉(zhuǎn)基因株系。圖7
圖7 轉(zhuǎn)基因煙草各株系在不同光強(qiáng)下的胞間CO2濃度
Fig. 7 Intercellular CO2concentration of transgenic tobacco lines under different light intensities
2.4.4 蒸騰速率(Tr)的影響
研究表明，盡管轉(zhuǎn)基因三個(gè)株系的Tr均比野生型的Tr較高，但是只有株系L3的Tr在240、450 μmol/(m2·s)光強(qiáng)處理后與普通野生型存在明顯差異，較低光強(qiáng)75 μmol/(m2·s)處理后，三個(gè)株系的蒸騰速率整體均比野生型略高，但之間差異不顯著；而240 μmol/(m2·s)處理后，株系L3的蒸騰速率Tr是野生型煙草蒸騰速率的2.28倍，株系L1、L2與普通野生型無明顯差異；450 μmol/(m2·s)處理后，株系L3的Tr是普通野生型的1.4倍，而株系L1、L2的Tr則分別比普通野生型高了5%、13%。圖8
圖8 轉(zhuǎn)基因煙草各株系在不同光強(qiáng)下蒸騰速率
Fig. 8 Transpiration rate of each line of transgenic tobacco under different light intensities
2.4.5 水分利用效率(WUE)的影響
研究表明，240 μmol/(m2·s)處理下三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與普通野生型相差較大，但只有株系L1與普通野生型存在顯著差異；較低光強(qiáng)(75 μmol/(m2·s))下，L3的WUE與普通野生型差異顯著；較高光強(qiáng)(450 μmol/(m2·s))處理下，株系L3則出現(xiàn)了水分利用效率比普通野生型 低的情況，且各株系與普通野生型的差異也逐漸縮小，水分利用效率WUE=Pn/Tr ，即單位葉面積上葉片的凈光合速率與蒸騰速率之比，不同光強(qiáng)處理下，水分利用效率出現(xiàn)明顯差異，正常光強(qiáng)(240 μmol/(m2·s))轉(zhuǎn)基因株系與普通野生型的相對差異較大，而較低光強(qiáng)(75 μmol/(m2·s))和較高光強(qiáng)(450 μmol/(m2·s))下，轉(zhuǎn)基因株系與普通野生型的相對差異較小。圖9
圖9 轉(zhuǎn)基因煙草各株系與普通野生型的水分利用效率相對差異
Fig. 9 Relative difference in water use efficiency between transgenic tobacco lines and wild-type
3 討 論
3.1 轉(zhuǎn)PsbS基因?qū)煵萑~綠素含量的影響
有研究表明[9]植物會(huì)通過改變形態(tài)特征或生物量分配來提高生存適合度與競爭力，葉片作為煙草光合作用的基礎(chǔ)，其較大的生物量有利于煙草捕獲光能，維持光合作用的高速運(yùn)轉(zhuǎn)，從而避免因光能過剩形成的光抑制[10]。研究中，生長前期轉(zhuǎn)基因煙草的葉片比野生型增長較快，與水稻中PsbS缺陷的植株在苗期顯示出生長遲緩，并且在生殖階段的適應(yīng)性降低[11]等結(jié)果相一致，這樣使轉(zhuǎn)基因植株更快速的捕獲光能，導(dǎo)致了后期對葉片葉綠素含量及光合產(chǎn)生了影響。
反應(yīng)中吸收利用光能的主要色素-葉綠素與光合速率之間有著密切的關(guān)系[12]，除少數(shù)特殊狀態(tài)下的葉綠素a分子作為作用中心色素外，其余的葉綠素a和葉綠素b均為聚光色素[13]。在一定范圍內(nèi)，葉綠素含量的增加可以增強(qiáng)葉綠體對光能的吸收與轉(zhuǎn)化，進(jìn)而增強(qiáng)光合速率。因此，葉片中葉綠素含量的高低是反映植物光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)[14]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系葉綠素a、b含量與野生型煙草間差異顯著，PsbS基因?qū)霟煵莺笤谌~片中得到了表達(dá)使轉(zhuǎn)基因煙草株系的葉綠素含量增加，延緩了功能葉片的衰老。
3.2 不同光強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因煙草光合的影響
PsbS蛋白是光系統(tǒng)II處結(jié)合葉綠素結(jié)合蛋白[15,16]。PsbS蛋白之所以被認(rèn)為在能量耗散中起著關(guān)鍵性的作用[17]，主要是強(qiáng)光照導(dǎo)致類囊體膜的酸化[18]；正是因?yàn)镻sbS感受了類囊體膜腔的酸度變化[19,20]進(jìn)而引起qE以及葉黃素循環(huán)來起到光保護(hù)的作用。作為能態(tài)淬滅產(chǎn)生的關(guān)鍵蛋白之一，它是光系統(tǒng)II超級(jí)復(fù)合體的蛋白組分之一，更是耗散過剩光能不可或缺的部分，在葉綠體熒光的非光化學(xué)淬滅(non-photochemical quenching, NPQ)中發(fā)揮著重要作用[17]。光合速率是表示植物在單位面積在單位時(shí)間內(nèi)的 CO2吸收量，或者是 O2釋放量，通常情況下植物光合速率值越高，說明植物的生理狀態(tài)越好[21]，實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)PsbS基因的煙草植株進(jìn)行了光合速率的測定，發(fā)現(xiàn)不同光強(qiáng)下轉(zhuǎn)基因煙草的凈光合速率普遍都比野生型煙草的高，結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因的煙草促進(jìn)了葉片的生長，與 Zhang M等[22]的研究結(jié)果一致，在東南景天中，超表達(dá)SaPsbS基因能夠促進(jìn)煙草的生長，并且能增加煙草的Fv/Fm值，相反的，擬南芥突變體npq4由于缺失PsbS基因而導(dǎo)致植物生長受抑制[23]，由于PsbS在高等植物中的作用是普遍的，因此，這種操作應(yīng)該對所有作物都有效，可能為提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)提供了巨大潛力[3]。
試驗(yàn)中在光強(qiáng)度一定的情況下，隨著光照時(shí)間的延長，在適宜植株生長的4 h時(shí)達(dá)到光合最高，這印證了高志民等[24]的毛竹PsbS基因在41℃下誘導(dǎo)4 h的表達(dá)效果最好,誘導(dǎo)時(shí)間明顯影響PePsbS基因的表達(dá)，隨后降低，趨于平衡。同時(shí)通過比較不同光強(qiáng)處理下的轉(zhuǎn)PsbS基因煙草光合性能指標(biāo)表明，在較低光條件下生長的煙草，凈光合速率(Pn)較低，胞間CO2濃度(Ci)較高，氣孔導(dǎo)度(Gs)較低，說明煙草葉片對CO2同化不能與光能吸收相協(xié)調(diào)，在光能捕獲不足的情況下最終引起Pn下降；在光合速率較低的情況下通過減少水分的散失從而來適應(yīng)弱光環(huán)境[14]，試驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因株系在較低光強(qiáng)下(75 μmol/(m2·s))與正常生長條件(240 μmol/(m2·s))的水分利用效率相比，表現(xiàn)出明顯的下降趨勢，較高光強(qiáng)(450 μmol/(m2·s))與之相比，同樣出現(xiàn)明顯下降趨勢，可以猜想，隨著光照強(qiáng)度的增加(>450 μmol/(m2·s))，轉(zhuǎn)基因株系的水分利用效率會(huì)逐漸升高，與普通野生型的相對差異會(huì)逐漸呈現(xiàn)反向增長狀態(tài)，具體情況有待進(jìn)一步研究。而蒸騰速率(Tr)的下降可能與氣孔的閉合有關(guān)，轉(zhuǎn)基因煙草株系比野生型煙草有較高的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，使其能維持較高的光合速率和積累更多的光合作用產(chǎn)物為結(jié)實(shí)提供需要。
4 結(jié) 論
轉(zhuǎn)GhPsbS基因的煙草苗期葉面積的增長比野生型煙草快，移栽后19、22、26和30 d轉(zhuǎn)基因株系的平均葉面積分別是普通野生型的葉面積的3.57、3.54、2.64、2.72倍，再次驗(yàn)證了該基因能促進(jìn)植株的生長，且葉綠素a、b含量間也存在顯著差異，普通野生型的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量分別為0.417、0.1743、0.708，而轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量分別為0.689、0.223、0.845，較普通野生型分別增長了65%、56%、19%；光合特性方面，轉(zhuǎn)GhPsbS基因的煙草表現(xiàn)出了增強(qiáng)的光合特性，不同光照強(qiáng)度下，轉(zhuǎn)GhPsbS基因株系的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導(dǎo)度(Gs)均高于野生型煙草。在較高光強(qiáng)450 μmol/(m2·s)條件下，轉(zhuǎn)基因株系的Pn較普通野生型分別高了11.5%、13.7%、30.1%，轉(zhuǎn)基因株系的Tr分別為1.37、1.47、1.82，普通野生型的Tr為1.30，同時(shí)轉(zhuǎn)基因株系的Gs分別為0.047、0.054、0.064，比普通野生型分別高了6.8%、22.7%、45.5%。綜上說明轉(zhuǎn)GhPsbS基因煙草較野生型具有較強(qiáng)的光合能力。實(shí)驗(yàn)的結(jié)論與田間試驗(yàn)存在明顯差異，驗(yàn)證轉(zhuǎn)入該基因的棉花的具體功能時(shí)，選擇田間試驗(yàn)更具有可靠性。
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(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)
0 引 言
【研究意義】高等植物具有光保護(hù)機(jī)制，可以減輕光帶來的有害影響，非光化學(xué)猝滅(NPQ)是光保護(hù)機(jī)制之一[1]，PsbS被認(rèn)為僅存在于高等植物中，通過與天線蛋白的相互作用來激活NPQ[2]，研究PsbS基因在光系統(tǒng)II中的功能對今后選育高光效棉花品種具有現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有研究表明，通過表達(dá)調(diào)節(jié)QA氧化還原狀態(tài)，影響氣孔導(dǎo)度和葉片的水分利用效率[3]；過量表達(dá)PePsbS1和PePsbS2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物均顯示出增強(qiáng)的光保護(hù)作用，而且PePsbS1和PePsbS2的表達(dá)還可以恢復(fù)擬南芥npq4突變體的NPQ[4]。已經(jīng)對該基因在棉花中進(jìn)行了克隆和功能初步分析[5]，該基因能響應(yīng)多種脅迫及不同的光照處理?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】該基因相關(guān)研究主要集中在熒光特性方面，而光合方面研究則相對較少。研究比較煙草中過量表達(dá)PsbS株系與野生型的表型差異。【擬解決關(guān)鍵問題】比較煙草中過量表達(dá)PsbS株系與野生型的光合相關(guān)參數(shù)，研究棉花PsbS基因在光保護(hù)中作用機(jī)制。對PsbS基因在棉花中的具體功能進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。
1 材料與方法
1.1 材 料
試驗(yàn)三個(gè)純系(3個(gè)純合株系L1、L2、L3)已克隆完成的過表達(dá)載體pGWB17-GhPsbS，及已轉(zhuǎn)化完成的T2代過量表達(dá)PsbS煙草、普通野生型煙草(WT)，種植在新疆兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室。
1.2 方 法
1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
選擇三個(gè)煙草株系L1、L2、L3種子均勻點(diǎn)播在1/2 MS培養(yǎng)基中。25～30 d，采用盆栽試驗(yàn)，將幼苗移栽入花盆中，以基質(zhì)和蛭石按3∶1比例混合裝入直徑為15 cm、高12 cm 的花盆，每盆移栽一株，轉(zhuǎn)基因煙草(3個(gè)純合株系L1、L2、L3)與野生型煙草各移種9盆，放入人工氣候室生長，定期澆適量的水，人工氣候室光照為240 μmol/(m2·s)，溫度為20℃。
生長期間不定期測量各株系的葉面積；當(dāng)?shù)?片葉完全展開時(shí)，取樣測葉綠素含量；在光照培養(yǎng)箱進(jìn)行不同光強(qiáng)處理：75(較低光強(qiáng))、240 (正常光強(qiáng))、450 μmol/(m2·s)(較高光強(qiáng))，4 h后采用LI-6400 型便攜式光合系統(tǒng)儀(美國Li-cor公司)測量各株系間的光合特性。
1.2.2 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定
根據(jù)改良的CTAB法提取抗性植株的葉片DNA[6]，設(shè)計(jì)PsbS特異引物F：5'-CACCATGGCTCAAACAATGCTGGTAAT-3'，R：5'-GTCTTCTTCCGCTTCAT
CAGTAAC-3' (由上海捷瑞生物工程有限公司合成)。利用該對引物，以提取的煙草DNA為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。其條件為 94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；16℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下檢測PCR產(chǎn)物，驗(yàn)證為陽性植株的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.3 葉面積測定
不同生長時(shí)期用長寬法測定煙草葉片葉面積[7]，計(jì)算葉面積(葉面積/cm2=0.707 5×長×寬)，轉(zhuǎn)基因3個(gè)株系與野生型各隨意選取5株，每株選擇最大葉長寬。
1.2.4 葉綠素( Chl) 及類胡蘿卜素含量測定
參考張蜀秋等[8]的方法并有所改進(jìn)，采用直接浸提法，避開葉脈取葉片圓片用80%的丙酮溶液提取(葉片1.1 cm打孔器4片稱重+13 mL丙酮溶液)，試管用黑布遮住置于黑暗室溫條件下放置72 h，期間搖動(dòng)數(shù)次至各綠色器官圓片呈白色時(shí)，取其上清液用U-5100 UV/VIS 型分光光度計(jì)(日本)于663、645和470 nm波長下比色，用80%丙酮作空白對照。每個(gè)株系及野生型煙草取5株的平均值為測定值。計(jì)算出提取液中葉綠素a和葉綠素b的含量，葉綠素含量計(jì)算公式如下(Lichtenthaler，1983)：
葉綠素a的含量(mg/g)= (12.21D663-2.81D646)×V/W.
葉綠素b的含量(mg/g)= (20.13D646-5.03D663)×V/W.
類胡蘿卜含量(mg/g)=(1 000D470 - 3.27C(Chla)- 104C(Chlb))/229.
式中D663、D645、D470 分別為相應(yīng)波長下的光密度值，V為提取液體積，W為所取葉片鮮重。
1.2.5 光合特性測定
人工氣候箱溫度設(shè)為28℃，濕度為37%，75、240、450 μmol/(m2·s)三個(gè)光強(qiáng)下轉(zhuǎn)基因株系各3株，野生型3株。儀器使用開放式氣路，內(nèi)置光源，測定轉(zhuǎn)基因各植株凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)等指標(biāo)。測定時(shí)選擇植株相同葉片，選取大致相同的部位，最后取各株系的平均值與野生型進(jìn)行比較。
1.3 數(shù)據(jù)處理
原始數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010 軟件，分別計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，并繪制圖表。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0 進(jìn)行顯著性分析，圖中小寫字母和“*”表示轉(zhuǎn)基因與野生型煙草在P< 0.05水平上差異顯著。
2 結(jié)果與分析
2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得
分別提取野生型和抗性株系的 DNA，以PsbS基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在轉(zhuǎn)化株系中都分別擴(kuò)增出預(yù)期目的條帶，在野生型煙草植株中未擴(kuò)增出目的條帶，已驗(yàn)證植株為轉(zhuǎn)基因的用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖1
注：M：Marker；1～3：轉(zhuǎn)PsbS基因植株；4：WT；5：陰性對照；6：陽性對照
Note: M:Marker; 1-3: transgenic PsbS gene plants; 4: WT; 5: negative control; 6: positive control
圖1 轉(zhuǎn)PsbS基因煙草鑒定
Fig. 1 Identification of transgenic PsbS tobacco
2.2 葉面積差異
研究表明，轉(zhuǎn)PsbS基因煙草生長前期的葉片增長幅度明顯比野生型煙草葉片增長的快。從移栽入土中開始，19～30 d，轉(zhuǎn)基因3個(gè)株系與野生型均差異顯著。第19 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的平均葉面積是普通野生型的2.36倍，22 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的葉面積是普通野生型的2.39倍，而到第30 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草的葉面積是普通野生型的1.66倍。移栽前期轉(zhuǎn)PsbS基因煙草明顯較野生型生長較快，30 d時(shí)增長幅度已呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。圖2
與野生型相比，轉(zhuǎn)PsbS基因的煙草前期葉片明顯偏大，而到40 d左右差異逐漸減小。該基因在某種程度上促進(jìn)了煙草葉片前期的快速生長。圖3
圖2 轉(zhuǎn)PsbS基因煙草與野生型煙草不同時(shí)期葉面積比較
Fig. 2 Comparison of Leaf Areas between TransgenicPsbSGene and Wild Type Tobacco in Different Periods
圖3 轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草生長狀況
Fig. 3 Growth status of transgenic tobacco and wild type tobacco
2.3 轉(zhuǎn)PsbS基因煙草株系葉綠素及類胡蘿卜素含量
研究表明，轉(zhuǎn)基因株系L3的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量與普通野生型差異都極顯著，L3的葉綠素a和葉綠素b含量分別是普通野生型的1.39倍和1.62倍，且其類胡蘿卜素含量比普通野生型高了37%，L1和L3的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量與普通野生型雖沒有太大差異，但均高于普通野生型。而葉綠素a/b含量有所不同，普通野生型的含量顯著高于轉(zhuǎn)基因兩個(gè)株系。轉(zhuǎn)PsbS基因能夠提高煙草的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。圖4
注：A:葉綠素a; B:葉綠素b; C:類胡蘿卜素; D:葉綠素a/b
Note: A: chlorophyll a; B: chlorophyll b; C: carotenoid; D: chlorophyll a/b
圖4 轉(zhuǎn)基因煙草株系葉綠素和類胡蘿卜素含量
Fig. 4 The strain of transgenic tobacco chlorophyll and Carotenoid content
圖5 轉(zhuǎn)基因煙草各株系不同光強(qiáng)下的凈光合速率
Fig. 5 Net photosynthetic rate of different lines of transgenic tobacco under different light intensities
2.4 轉(zhuǎn)PsbS基因煙草的光合特性
2.4.1 凈光合速率(Pn)的影響
研究表明，三個(gè)株系(L1、L2、L3)與野生型(普通野生型)間差異顯著；在與生長光照相同的240 μmol/(m2·s) 光照處理后，三個(gè)株系均與普通野生型存在顯著差異，株系L3的光合速率是普通野生型的3倍，而株系L1、L2的凈光合速率則是普通野生型的2倍，同時(shí)轉(zhuǎn)基因株系間也存在差異；低光強(qiáng)75 μmol/(m2·s)下光合速率雖然都有所下降，但轉(zhuǎn)基因株系的凈光合速率還是高于野生型的光合速率，較高光強(qiáng)450 μmol/(m2·s)下L1、L2轉(zhuǎn)基因株系的光合速率比240 μmol/(m2·s)明顯有所升高。
2.4.2 氣孔導(dǎo)度(Gs)的影響
轉(zhuǎn)基因株系L3在240 、450 μmol/(m2·s)光強(qiáng)下的氣孔導(dǎo)度與野生型間差異顯著，分別是普通野生型的2.26、1.46倍；雖然株系L1、L2在三個(gè)光強(qiáng)處理下與野生型間無差異，但轉(zhuǎn)基因三個(gè)株系在不同光強(qiáng)下氣孔導(dǎo)度均略高于野生型煙草的氣孔導(dǎo)度。圖6
圖6 轉(zhuǎn)基因煙草各株系在不同光強(qiáng)下的氣孔導(dǎo)度
Fig. 6 Stomatal conductance of transgenic tobacco lines under different light intensities
2.4.3 胞間CO2濃度(Ci)的影響
研究表明，不同光強(qiáng)處理后，野生型普通野生型的胞間CO2濃度明顯比轉(zhuǎn)基因株系的Ci高，但二者間的胞間CO2濃度無顯著差異。當(dāng)處理光強(qiáng)為75 μmol/(m2·s)時(shí)，只有轉(zhuǎn)基因株系L2與普通野生型差異顯著，且普通野生型的Ci是株系L2的1.3倍，分別比L1、L3高了15%、18%；而與生長光強(qiáng)一致的240 μmol/(m2·s)和較高光強(qiáng)(450 μmol/(m2·s))處理后，轉(zhuǎn)基因各株系與普通野生型間雖無顯著差異，普通野生型的Ci高于轉(zhuǎn)基因株系。圖7
圖7 轉(zhuǎn)基因煙草各株系在不同光強(qiáng)下的胞間CO2濃度
Fig. 7 Intercellular CO2concentration of transgenic tobacco lines under different light intensities
2.4.4 蒸騰速率(Tr)的影響
研究表明，盡管轉(zhuǎn)基因三個(gè)株系的Tr均比野生型的Tr較高，但是只有株系L3的Tr在240、450 μmol/(m2·s)光強(qiáng)處理后與普通野生型存在明顯差異，較低光強(qiáng)75 μmol/(m2·s)處理后，三個(gè)株系的蒸騰速率整體均比野生型略高，但之間差異不顯著；而240 μmol/(m2·s)處理后，株系L3的蒸騰速率Tr是野生型煙草蒸騰速率的2.28倍，株系L1、L2與普通野生型無明顯差異；450 μmol/(m2·s)處理后，株系L3的Tr是普通野生型的1.4倍，而株系L1、L2的Tr則分別比普通野生型高了5%、13%。圖8
圖8 轉(zhuǎn)基因煙草各株系在不同光強(qiáng)下蒸騰速率
Fig. 8 Transpiration rate of each line of transgenic tobacco under different light intensities
2.4.5 水分利用效率(WUE)的影響
研究表明，240 μmol/(m2·s)處理下三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系與普通野生型相差較大，但只有株系L1與普通野生型存在顯著差異；較低光強(qiáng)(75 μmol/(m2·s))下，L3的WUE與普通野生型差異顯著；較高光強(qiáng)(450 μmol/(m2·s))處理下，株系L3則出現(xiàn)了水分利用效率比普通野生型 低的情況，且各株系與普通野生型的差異也逐漸縮小，水分利用效率WUE=Pn/Tr ，即單位葉面積上葉片的凈光合速率與蒸騰速率之比，不同光強(qiáng)處理下，水分利用效率出現(xiàn)明顯差異，正常光強(qiáng)(240 μmol/(m2·s))轉(zhuǎn)基因株系與普通野生型的相對差異較大，而較低光強(qiáng)(75 μmol/(m2·s))和較高光強(qiáng)(450 μmol/(m2·s))下，轉(zhuǎn)基因株系與普通野生型的相對差異較小。圖9
圖9 轉(zhuǎn)基因煙草各株系與普通野生型的水分利用效率相對差異
Fig. 9 Relative difference in water use efficiency between transgenic tobacco lines and wild-type
3 討 論
3.1 轉(zhuǎn)PsbS基因?qū)煵萑~綠素含量的影響
有研究表明[9]植物會(huì)通過改變形態(tài)特征或生物量分配來提高生存適合度與競爭力，葉片作為煙草光合作用的基礎(chǔ)，其較大的生物量有利于煙草捕獲光能，維持光合作用的高速運(yùn)轉(zhuǎn)，從而避免因光能過剩形成的光抑制[10]。研究中，生長前期轉(zhuǎn)基因煙草的葉片比野生型增長較快，與水稻中PsbS缺陷的植株在苗期顯示出生長遲緩，并且在生殖階段的適應(yīng)性降低[11]等結(jié)果相一致，這樣使轉(zhuǎn)基因植株更快速的捕獲光能，導(dǎo)致了后期對葉片葉綠素含量及光合產(chǎn)生了影響。
反應(yīng)中吸收利用光能的主要色素-葉綠素與光合速率之間有著密切的關(guān)系[12]，除少數(shù)特殊狀態(tài)下的葉綠素a分子作為作用中心色素外，其余的葉綠素a和葉綠素b均為聚光色素[13]。在一定范圍內(nèi)，葉綠素含量的增加可以增強(qiáng)葉綠體對光能的吸收與轉(zhuǎn)化，進(jìn)而增強(qiáng)光合速率。因此，葉片中葉綠素含量的高低是反映植物光合能力的一個(gè)重要指標(biāo)[14]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系葉綠素a、b含量與野生型煙草間差異顯著，PsbS基因?qū)霟煵莺笤谌~片中得到了表達(dá)使轉(zhuǎn)基因煙草株系的葉綠素含量增加，延緩了功能葉片的衰老。
3.2 不同光強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因煙草光合的影響
PsbS蛋白是光系統(tǒng)II處結(jié)合葉綠素結(jié)合蛋白[15,16]。PsbS蛋白之所以被認(rèn)為在能量耗散中起著關(guān)鍵性的作用[17]，主要是強(qiáng)光照導(dǎo)致類囊體膜的酸化[18]；正是因?yàn)镻sbS感受了類囊體膜腔的酸度變化[19,20]進(jìn)而引起qE以及葉黃素循環(huán)來起到光保護(hù)的作用。作為能態(tài)淬滅產(chǎn)生的關(guān)鍵蛋白之一，它是光系統(tǒng)II超級(jí)復(fù)合體的蛋白組分之一，更是耗散過剩光能不可或缺的部分，在葉綠體熒光的非光化學(xué)淬滅(non-photochemical quenching, NPQ)中發(fā)揮著重要作用[17]。光合速率是表示植物在單位面積在單位時(shí)間內(nèi)的 CO2吸收量，或者是 O2釋放量，通常情況下植物光合速率值越高，說明植物的生理狀態(tài)越好[21]，實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)PsbS基因的煙草植株進(jìn)行了光合速率的測定，發(fā)現(xiàn)不同光強(qiáng)下轉(zhuǎn)基因煙草的凈光合速率普遍都比野生型煙草的高，結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因的煙草促進(jìn)了葉片的生長，與 Zhang M等[22]的研究結(jié)果一致，在東南景天中，超表達(dá)SaPsbS基因能夠促進(jìn)煙草的生長，并且能增加煙草的Fv/Fm值，相反的，擬南芥突變體npq4由于缺失PsbS基因而導(dǎo)致植物生長受抑制[23]，由于PsbS在高等植物中的作用是普遍的，因此，這種操作應(yīng)該對所有作物都有效，可能為提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)提供了巨大潛力[3]。
試驗(yàn)中在光強(qiáng)度一定的情況下，隨著光照時(shí)間的延長，在適宜植株生長的4 h時(shí)達(dá)到光合最高，這印證了高志民等[24]的毛竹PsbS基因在41℃下誘導(dǎo)4 h的表達(dá)效果最好,誘導(dǎo)時(shí)間明顯影響PePsbS基因的表達(dá)，隨后降低，趨于平衡。同時(shí)通過比較不同光強(qiáng)處理下的轉(zhuǎn)PsbS基因煙草光合性能指標(biāo)表明，在較低光條件下生長的煙草，凈光合速率(Pn)較低，胞間CO2濃度(Ci)較高，氣孔導(dǎo)度(Gs)較低，說明煙草葉片對CO2同化不能與光能吸收相協(xié)調(diào)，在光能捕獲不足的情況下最終引起Pn下降；在光合速率較低的情況下通過減少水分的散失從而來適應(yīng)弱光環(huán)境[14]，試驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因株系在較低光強(qiáng)下(75 μmol/(m2·s))與正常生長條件(240 μmol/(m2·s))的水分利用效率相比，表現(xiàn)出明顯的下降趨勢，較高光強(qiáng)(450 μmol/(m2·s))與之相比，同樣出現(xiàn)明顯下降趨勢，可以猜想，隨著光照強(qiáng)度的增加(>450 μmol/(m2·s))，轉(zhuǎn)基因株系的水分利用效率會(huì)逐漸升高，與普通野生型的相對差異會(huì)逐漸呈現(xiàn)反向增長狀態(tài)，具體情況有待進(jìn)一步研究。而蒸騰速率(Tr)的下降可能與氣孔的閉合有關(guān)，轉(zhuǎn)基因煙草株系比野生型煙草有較高的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率，使其能維持較高的光合速率和積累更多的光合作用產(chǎn)物為結(jié)實(shí)提供需要。
4 結(jié) 論
轉(zhuǎn)GhPsbS基因的煙草苗期葉面積的增長比野生型煙草快，移栽后19、22、26和30 d轉(zhuǎn)基因株系的平均葉面積分別是普通野生型的葉面積的3.57、3.54、2.64、2.72倍，再次驗(yàn)證了該基因能促進(jìn)植株的生長，且葉綠素a、b含量間也存在顯著差異，普通野生型的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量分別為0.417、0.1743、0.708，而轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量分別為0.689、0.223、0.845，較普通野生型分別增長了65%、56%、19%；光合特性方面，轉(zhuǎn)GhPsbS基因的煙草表現(xiàn)出了增強(qiáng)的光合特性，不同光照強(qiáng)度下，轉(zhuǎn)GhPsbS基因株系的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)和氣孔導(dǎo)度(Gs)均高于野生型煙草。在較高光強(qiáng)450 μmol/(m2·s)條件下，轉(zhuǎn)基因株系的Pn較普通野生型分別高了11.5%、13.7%、30.1%，轉(zhuǎn)基因株系的Tr分別為1.37、1.47、1.82，普通野生型的Tr為1.30，同時(shí)轉(zhuǎn)基因株系的Gs分別為0.047、0.054、0.064，比普通野生型分別高了6.8%、22.7%、45.5%。綜上說明轉(zhuǎn)GhPsbS基因煙草較野生型具有較強(qiáng)的光合能力。實(shí)驗(yàn)的結(jié)論與田間試驗(yàn)存在明顯差異，驗(yàn)證轉(zhuǎn)入該基因的棉花的具體功能時(shí)，選擇田間試驗(yàn)更具有可靠性。
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