林 波，鄭鳳錦，任 紅，方曉純，陳趕林

(1. 廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣西 南寧 530007；2. 廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530007；3. 三亞市南繁科學技術(shù)研究院，海南 三亞 572000；4. 廣西農(nóng)業(yè)科學院，廣西 南寧 530007)

【研究意義】蓮霧(Syzygiumsamarangense)，又名洋蒲桃、爪哇蒲桃等，屬熱帶水果，在我國臺灣、海南、福建、廣東、廣西、四川和云南等地均有種植[1]。蓮霧花的膳食纖維、維生素C、氨基酸含量高，具有多種礦物質(zhì)和功能性成分，在保健功效和藥用價值上極具開發(fā)前景[2]。一般來說，5年生的蓮霧樹正?；ㄋ胗?000穗以上，每穗的花蕊數(shù)約有11～21個。在生產(chǎn)上，為達到提高果實產(chǎn)量和質(zhì)量，約90 %的花會被人為疏掉，造成蓮霧花資源的浪費[3]。蓮霧花具特有的蓮霧香，揮發(fā)性成分豐富，以萜烯類為主，并含有多種生物活性成分，可作花茶飲，湯色黃綠明亮。因此，挖掘蓮霧花的功能性成分，對于開發(fā)新型營養(yǎng)產(chǎn)品，提高蓮霧花的綜合利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物多酚是指在植物體內(nèi)由沒食子酸或其聚合物的葡萄糖醇、黃烷醇及其衍生物的聚合物以及二者共同組成的植物多元酚[4]，目前已鑒定出8000多種酚類物質(zhì)，按結(jié)構(gòu)特征可分為類黃酮類、酚酸類、酚醇類、芪類和木酚素類[5]；具有抗氧化、抗菌消炎、降血糖血脂等功效[6]，是具多元酚結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，廣泛存在于植物體內(nèi)花、根、皮、果實中[7-9]。鄧俊琳等[10]研究發(fā)現(xiàn)絞股藍的葉中總多酚含量高于莖中，醇提液的抗氧化活性也強于莖。孫洲悅等[11]研究表明辣木葉多酚對曲霉菌、畢赤酵母菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用，對兩種霉菌的抑制效果比對2種桿菌的抑制效果好。蓮霧是集食用、藥用、觀賞、綠化等多功能價值的木本植物，其果、根、葉和皮都具有藥用價值，據(jù)相關(guān)報道，目前，對蓮霧的研究主要集中在果實采后貯藏保鮮[12-13]、果實營養(yǎng)成分分析及提取[14-16]、香氣成分[3,17-18]等方面?！颈狙芯壳腥朦c】蓮霧果實中黃酮含量最高，其次是葉子，含量最低是花[2,16]但關(guān)于蓮霧花中多酚化合物以及提取蓮霧花多酚方法的相關(guān)研究鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以蓮霧干花為主要原料，進行以乙醇為溶劑，超聲波輔助提取蓮霧花中多酚，并對提取工藝進行響應(yīng)面法優(yōu)化，同時對蓮霧花多酚提取液進行體外抗氧化能力進行分析，以期下一步對蓮霧花多酚化合物功能活性深入研究，為開發(fā)多元化高附加值產(chǎn)品提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蓮霧花品種為黑珍珠(7年樹齡)，于2017年3月26日采自三亞南鹿實業(yè)有限公司；主要試劑為：福林-酚、無水乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸等，均為分析純；沒食子酸、抗壞血酸等均為優(yōu)級純(國藥集團化學試劑有限公司)。主要試驗儀器及設(shè)備為：WND-200型高速中藥粉碎機(浙江省蘭溪市偉能達電器有限公司)、101-2AB型電熱風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、JAC-300N型多功能超聲波功率應(yīng)用設(shè)備(山東省濟寧市奧波超聲電氣設(shè)備有限公司)；ATX 224 電子分析天平(日本島津公司)；GENESYS型紫外/可見掃描分光光度計[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、SIGMA3K15型高速冷凍離心機(德國希格瑪離心機有限公司)。

1.2 試驗方法

將采摘后蓮霧花鮮樣于105 ℃ 下烘干、粉碎后保存?zhèn)溆茫?jīng)測定，蓮霧花干粉的水分含量7.65 %。蓮霧花多酚提取工藝流程如下：蓮霧干花→粉碎、過篩→精確稱重→添加提取溶劑→超聲波提取→離心過濾10 min(4000 r/min)→上清液→減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(100 r/min、40 ℃濃縮30 min)→蓮霧花多酚提取液

1.2.1 提取液濃度對蓮霧花多酚得率的影響試驗 在料液比1∶20 g/mL、提取時間1 h、提取溫度50 ℃、超聲波功率150 W的條件下，以不同體積分數(shù)的乙醇(45 %、55 %、65 %、75 %、85 %、95 %)為提取溶劑，考察提取液濃度對蓮霧花多酚得率的影響。

1.2.2 提取時間對蓮霧花多酚得率的影響試驗 在料液比1∶20 g/mL、乙醇提取液濃度75 %、提取溫度50 ℃、超聲波功率150 W的條件下，以不同超聲時間(0.5、1、2、3、4、5 h)提取，考察提取時間對蓮霧花多酚得率的影響。

1.2.3 超聲波功率對蓮霧花多酚得率的影響試驗 在料液比1∶20 g/mL、提取時間1 h、提取溫度50 ℃、乙醇提取液濃度75 %的條件下，以不同超聲波功率(120、150、180、210、240 W)提取，考察超聲波功率對蓮霧花多酚得率的影響。

1.2.4 提取溫度對蓮霧花多酚得率的影響試驗 在料液比1∶20 g/mL、提取時間1 h、乙醇提取液濃度75 %、超聲波功率150 W的條件下，以不同提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)提取，考察提取溫度對蓮霧花多酚得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法試驗 根據(jù)Design-Expert 8.05b中Box-Benhnken實驗設(shè)計原理采用3 因素3水平的響應(yīng)面分析法，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取提取液濃度(%)、提取時間(h)、提取溫度(℃)為自變量，蓮霧花多酚得率為響應(yīng)值，進一步優(yōu)化確定超聲波輔助提取蓮霧花多酚的最佳工藝參數(shù)，驗證后的多酚提取液進行體外抗氧化性分析(表1)。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 多酚標準曲線制作 參照文獻[19]的方法，采用以沒食子酸為標準物質(zhì)的Folin-Ciocalteu法，以多酚質(zhì)量濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，所得標準曲線的方程為：Y=0.0041x+0.0483，R2=0.9974。

1.3.2 蓮霧花多酚得率的測定 取0.2 mL蓮霧花多酚提取液加入試管中，分別加入0.8 mL去離子水、0.2 mL福林-酚試劑，振搖試管使樣品充分混合，避光保存6 min后再加入7 % 碳酸鈉溶液2 mL和去離子水1.6 mL，避光放置90 min，接著測定其在760 nm的吸光度值。多酚得率=(A-A0)×V×100 / (SLOPEstd×m×1000)，式中：A為樣品測試液吸光度；A0為試劑空白液吸光度；SLOPEstd為沒食子酸標準曲線的斜率；V為樣品提取液體積(mL)；m為干粉質(zhì)量(g)。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平Table 1 Response surface test factors level

1.3.3 羥基自由基(·OH)清除率的測定[20]吸取不同體積的蓮霧多酚提取液于離心管中，用蒸餾水補足至2.0 mL后，依次加入2.0 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵溶液，2.0 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液搖勻，靜置10 min后，再加入2.0 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，混合搖勻，靜置30 min后置于510 nm波長處測其吸光值(Ai)。用蒸餾水替代水楊酸測得吸光值(Aj)?？瞻自囼炗谜麴s水替代不同體積試樣，測得吸光值(A0)；同時以VC為對照。測定3次取平均值，計算清除率：

·OH清除率(%)= [1-(Ai-Aj)/A0]× 100

1.3.4 還原力的測定[20]吸取不同體積的蓮霧多酚提取液于試管中，用蒸餾水補足至1 mL，加入2.5 mL的0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)及2.5 mL 鐵氰化鉀溶液(1 %)，50 ℃水浴20 min后急速冷卻，加入2.5 mL三氯乙酸溶液(10 %)，于3000 r/min離心10 min。取上清液0.5 mL，加蒸餾水8.5 mL及1 mL 0.1 %三氯化鐵溶液，混勻10 min后于700 nm處測定吸光度。吸光度值越大，說明還原能力越強。

圖1 不同提取液濃度對蓮霧花多酚得率的影響Fig.1 Effect of different extract concentrations on the polyphenols of Syzygium samarangense flowers

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液濃度對蓮霧花多酚得率的影響

由圖1可知，隨著提取液濃度的不斷升高，蓮霧花中多酚提取液的得率呈先升高后下降的趨勢。提取液濃度為55 %時，蓮霧花多酚得率最高，達到15.91 mg/g；當其濃度增大至95 %時，多酚的得率最低，僅為2.56 mg/g。這可能是由于乙醇作為提取液，乙醇的濃度越低，細胞滲透壓越小，對多酚的提取影響較??；而提取液濃度過高，蓮霧花中醇溶性的色素、親脂性的化合物容易析出，以致影響蓮霧花中多酚的提取，降低得率[21]。由此，蓮霧花中多酚的提液濃度適宜為55 %。

2.2 提取時間對蓮霧花多酚得率的影響

由圖2得知，蓮霧花的多酚隨著提取時間的增加，多酚得率顯著提高，在提取時間4 h時，多酚提取量最高；在提取時間超過4 h后，多酚提取量反而出現(xiàn)略微降低趨勢。這是隨著時間的延長，已溶出的多酚類物質(zhì)會不穩(wěn)定，易被氧化，且多酚的物質(zhì)結(jié)構(gòu)也易改變和受損，故多酚的提取量也開始下降[22]，因此，蓮霧多酚提取的適宜提取時間為4 h。

2.3 超聲波功率對蓮霧花多酚得率的影響

由圖3可知，蓮霧花多酚得率隨著功率的升高而逐漸增加。當超聲波功率為210 W時，蓮霧花多酚的提取量達到最高值15.52 mg/g，功率180 W的提取量次之，為15.39 mg/g，功率240 W的最少；當超聲波功率大于210 W時，蓮霧花的多酚得率呈明顯下降趨勢。這可能是功率增大時，超聲波產(chǎn)生的強烈振動會引起細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化及細胞壁的破壞，加快擴散和溶解速度，這與婁在祥的研究結(jié)果相似[23]。綜合考慮提取效果和設(shè)備的損耗，超聲波輔助提取蓮霧花中多酚的最適功率為180 W。

圖2 不同提取時間對蓮霧花多酚得率的影響Fig.2 Effect of different extraction time on the polyphenols of Syzygium samarangense flowers

圖3 不同提取功率對蓮霧花多酚得率的影響Fig.3 Effect of different ultrasonic power on the polyphenols of Syzygium samarangense flowers

2.4 提取溫度對蓮霧花多酚得率的影響

由圖4可知，不同提取溫度對蓮霧花多酚得率的影響差異明顯，隨著提取溫度的升高，蓮霧花中多酚的提取量呈現(xiàn)遞增趨勢。在超聲溫度60 ℃時，蓮霧花多酚的提取量最高；當超過溫度60 ℃后，多酚的提取量反而呈現(xiàn)降低趨勢。這是因為隨著溫度的不斷升高，蓮霧花中可溶性物質(zhì)的氫鍵容易斷裂，加快了多酚物質(zhì)的滲透性、溶解性和擴散速度，從而提高了多酚的提取量；而當提取溫度超過最適溫度后，多酚化合物物質(zhì)在較高溫度下趨于不穩(wěn)定，容易被氧化，還可能導(dǎo)致多酚的物質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞，使其多酚化合物提取量下降[24]，這與王敏等[25]對板栗殼多酚提取工藝研究中，提取溫度對得率的研究結(jié)果一致。因此，超聲波輔助提取蓮霧花多酚的最適提取溫度為60 ℃。

圖4 不同提取溫度對蓮霧花多酚得率的影響Fig.4 Effect of different extraction temperature on the polyphenols of Syzygium samarangense flowers

表2 響應(yīng)值實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response value experiment design and results

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic response surface regression model

注: * 代表顯著(P<0.05)；**表示極顯著(P<0.01)。
Note: * indicated significate difference (P<0.05); ** indicated highly significate difference (P<0.01).

2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)中心組合試驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，由于超聲波功率對蓮霧花多酚得率影響較小，故在使用響應(yīng)面優(yōu)化工藝時，選取提取液濃度、提取時間、提取溫度作為工藝優(yōu)化的因素，以提取量為響應(yīng)值(表2)。

根據(jù)中心組合試驗結(jié)果，以多酚提出率為響應(yīng)值，運用Design-Expert 8.05b軟件進行分析處理(表3)，并得多元二次回歸方程：

Y=12.67-2.35×A+0.51×B+0.36×C-0.049×AB+0.26AC+1.0BC+0.32A2+0.028B2-0.86C2。

2.6 響應(yīng)面圖形分析及工藝優(yōu)化

從圖5可知，提取液濃度和提取時間對蓮霧花多酚提取量的影響顯著，隨著提取液濃度和提取時間的增加，多酚提取量呈先升高后降低的趨勢，因此，在提取多酚工藝時，選擇合適的提取液濃度和時間可以提高多酚的提取量；如圖5-b所示，隨著提取溫度的升高和提取液濃度的增大，提取量開始下降。整體來看，提取液濃度對多酚提取量的影響要大于提取溫度。可見在實際提取工藝時，應(yīng)選最適的提取液濃度并適當控制提取溫度在最適范圍。由圖5-c可見，多酚提取量隨著提取時間的增加和提取溫度的升高呈現(xiàn)緩慢增大后下降的變化，在提取時間4 h和提取溫度60 ℃時，蓮霧多酚提取量達到最大值。因此，適當提高提取時間和提取溫度有利于多酚提取。

2.7 蓮霧花多酚提取工藝的優(yōu)化及驗證結(jié)果

利用Design-Expert 8.05b軟件對試驗數(shù)據(jù)優(yōu)化預(yù)測，進一步確定提取條件工藝最佳條件，得到多酚的提取優(yōu)化最佳條件是提取液濃度55 %、提取時間5 h、提取溫度60.63 ℃，預(yù)測得到蓮霧花多酚提取量為16.366 mg/g。為檢驗該響應(yīng)面優(yōu)化方法的可靠性，采用上述最適宜工藝條件進行超聲波輔助提取蓮霧花多酚的驗證試驗，同時為了實際操作的方便，將最適宜條件修正為提取液濃度55 %、提取時間5 h、提取溫度60 ℃，在固液比1∶20、超聲波功率180 W的條件下，實際測得的多酚提取量為16.51 mg/g，與理論預(yù)測值符合度較高，因此，采用響應(yīng)面優(yōu)化蓮霧花多酚的提取工藝條件參數(shù)準確可靠，證實了該方程的準確性和實用性。

圖5 各因素交互作用對蓮霧花多酚提取量影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of interactive effects for every various factors on acid amount

2.8 蓮霧花多酚的體外抗氧化性分析

按照響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化出的工藝條件提取出的蓮霧花多酚，將蓮霧花多酚提取液按一定比例稀釋20、100倍，以1 mmol/L的Vc濃度稀釋20倍作對照，配成不同體積濃度的樣液進行體外抗氧化性研究，結(jié)合圖6和圖7結(jié)果可以看出，隨著添加提取液體積增加清除作用逐步增強，多酚提取液對·OH的清除能力和還原能力這兩項指標都略高于同體積同濃度的Vc，這表明多酚提取液在體外具有抗氧化性。

3 討 論

多酚是具有一個或幾個苯環(huán)并結(jié)合多個羥基分子結(jié)構(gòu)的化合物總稱，不僅是植物體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物，還是植物感官、風味、營養(yǎng)品質(zhì)的影響因素[26]。植物多酚成分復(fù)雜、化學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，目前還沒有標準化的提取方法。常用的提取方法主要是加熱、回流提取，溶劑萃取，超聲波輔助、超臨界流體萃取、微波浸提、生物技術(shù)等[27]。這些方法各有優(yōu)缺點，如加熱、回流提取方法溫度過高導(dǎo)致多酚易氧化分解、得率低，且試劑使用量多；超臨界流體萃取、微波浸提具有提取物品質(zhì)好且得率高，但生產(chǎn)設(shè)備昂貴，成本較高。生物技術(shù)提取方法工藝簡單便捷、能源損耗低，但由于純度低、耗時長，不適于工業(yè)生產(chǎn)。而超聲波輔助提取方法提取溫度低、得率高且省時、成本低廉，成為日本提取植物多酚成分的主流提取方法[28]。林樅雨等[29]研究表明超聲波輔助提取甜玉米多酚，明顯優(yōu)于乙醇浸提法和微波提取法，提取率高達約96 %。蔣麗等[30]研究不同提取方法對茶多酚理化性質(zhì)評價，發(fā)現(xiàn)超聲波提取茶多酚的提取率高，相對于熱回流、酶法、纖維素酶協(xié)同超聲波法所得產(chǎn)品，該法產(chǎn)品純度、抗氧化活性優(yōu)勢更明顯。本研究采用超聲波輔助提取蓮霧花中多酚化合物，結(jié)果表明，在單因素試驗結(jié)果結(jié)合提取效果、實際生產(chǎn)和設(shè)備的損耗等各方面考慮，得到單因素最適條件；再此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗對提取工藝進行優(yōu)化，得到超聲波輔助提取優(yōu)化工藝，同時進行優(yōu)化工藝的實際驗證，與理論預(yù)測值相差不大。

圖6 蓮霧花多酚濃度和Vc羥基自由基清除率的關(guān)系Fig.6 Relationship between the syzygium samarangense flowers and Vc hydroxyl radical scavenging rate

蓮霧花具有較強的抗氧化性，主要是多酚化合物含有多個羥酚基，其抗氧化性與其結(jié)構(gòu)特性有著密切的關(guān)系[31]。多酚化合物在抗氧化反應(yīng)中直接清除或阻斷自由基鏈反應(yīng)，或與產(chǎn)生自由基相關(guān)的酶之間的相互作用，絡(luò)合誘導(dǎo)氧化的過量金屬離子，從而間接清除自由基[32]。經(jīng)大量研究表明，羥基自由基是一類對機體生物有較強破壞力的且很活躍的自由基[33]；還原力是基于Fe3+向Fe2+轉(zhuǎn)換的原理來判斷化合物抗氧化性的一個重要指標[19]。本研究對優(yōu)化工藝后的多酚提取液進行體外抗氧化性分析，結(jié)果顯示，對比同體積同濃度的Vc，隨著體積的增加，提取液對·OH的清除能力逐漸明顯高于Vc；在對還原力的比較中，提取液的吸光值也在不斷升高，且都比Vc的還原力強，都說明其抗氧化能力隨著多酚提取液濃度的增加而提高，這與相關(guān)研究報道結(jié)果一致[32]，具有較強的體外抗氧化性。由此可見，蓮霧花具有較好的營養(yǎng)功效，合理開發(fā)利用蓮霧花的功能活性，可提高蓮霧副產(chǎn)物的綜合利用價值。

圖7 蓮霧花多酚濃度和Vc的還原能力Fig.7 The syzygium samarangense flowers of polyphenol concentration and Vc reduction ability

4 結(jié) 論

響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲提取蓮霧花多酚的工藝，超聲波輔助提取蓮霧花多酚在固液比1∶20、超聲波功率180 W條件下，最佳提取工藝條件為提取液濃度55 %、提取時間5 h、提取溫度60 ℃，實驗測得的多酚提取量為16.51 mg/g。蓮霧花多酚提取液在一定的濃度內(nèi)，對·OH的清除能力和還原能力具有較強的體外抗氧化活性，為進一步研究蓮霧花提供數(shù)據(jù)參考。