張龍龍，韋 煒，鄧克學，詹瑪琍

肝纖維化作為慢性肝病的共同晚期階段，主要由慢性肝損傷誘導的肝星狀細胞活化、增殖引起。慢性肝病的主要特征為肝內(nèi)血管重建，包括：肝竇的毛細血管化及肝內(nèi)分流[1]，肝臟的血流灌注情況可在一定程度上評價肝纖維化和肝硬化[2]。新生血管的形成是肝纖維化的重要病理特征。肝纖維化區(qū)域的新生血管本身未成熟，無法改善局部的組織缺氧，屬于無功能血管，新血管生成又加重肝竇毛細血管化，促進肝纖維化發(fā)展；因此肝纖維化雖然微血管增生增多，但局部肝組織的實際血流灌注量減少[2-3]。病理學檢查為確定肝纖維化程度的“金標準”，但存在著有創(chuàng)性、假陰性及不能動態(tài)觀察和隨訪等缺陷。因此尋找非侵入性無創(chuàng)性定量診斷肝纖維化程度的方法在肝纖維化研究中備受矚目。

以瞬時雙千電子伏特 (kilo electron Volt，keV)為核心技術的雙能量能譜電子計算機斷層掃描技術(dual-energy spectrum computed tomography，DESCT)成像是計算機斷層掃描技術(computed tomography，CT)成像領域中的一項新技術。DESCT掃描覆蓋范圍廣，可以進行全臟器掃描，且CT能譜成像(gemstone spectral imaging，GSI)通過特定軟件和算法將傳統(tǒng)的X線混合能量圖像分解成不同keV水平的單能量圖像(40～140 keV)，可以對器官的多種物質(zhì)(如碘、水、鈣等)進行物質(zhì)定量分析和能譜綜合分析[4]，為評估肝纖維化的血流動力學改變提供了新的技術手段。該研究擬制作兔肝纖維化模型，應用GSI分析技術，測量動態(tài)增強掃描肝組織各期的密度值(通常稱亨氏單位，hounsfield unit，HU，即CT值)、碘含量及標準化碘含量(normalized iodine concentration，NIC)，研究隨纖維化程度的改變，肝組織碘攝入量的變化規(guī)律，探討能譜CT多模態(tài)成像技術在評估兔肝纖維化程度中的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選用6月齡雄性普通級新西蘭大白兔60只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg。由安徽省立醫(yī)院動物實驗中心采購，隨機分為對照組10只和實驗組50只；對照組分5個小組，每組2只；實驗組分為飼養(yǎng)4、6、8、10、12周組，每組10只；所有動物均飼養(yǎng)在層疊式不銹鋼絲籠中，采用安徽省立醫(yī)院動物實驗中心提供的基礎顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲用自來水，兔房通風良好噪聲較小，保持清潔，空氣濕度50%～70%，溫度20～29 ℃。

1.2 肝纖維化模型建立采取四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)與橄欖油50%濃度混合液0.5 ml/kg每周兩次皮下注射方式，連續(xù)注射時長分別為4、6、8、10及12 周，若動物出現(xiàn)拒食、活動減少等現(xiàn)象，酌情減少用量或停注1～2次。

1.3 影像學檢查及數(shù)據(jù)測量分別于4、6、8、10及12周隨機抽取實驗組10只及對照組2只行DESCT檢查。采用GE Discovery CT750 HD寶石CT機(美國GE公司)進行檢查前動物禁食12 h，禁水6 h，耳緣靜脈推注1%戊巴比妥4 ml/kg麻醉。麻醉后將其仰臥位固定于自制動物固定架上，行CT平掃及增強掃描：采用GSI模式掃描。掃描參數(shù)：視野250 mm×250 mm，探測器覆蓋范圍20 mm，螺旋掃描速度0.8 s/周，螺距 1.375 ∶1，準直寬度0.625 mm×64；電壓為高低能量分別為140千伏峰值 (kilo volt peak, kVp)和80 kVp，0.5 ms瞬時切換，管電流約為550 mA。經(jīng)耳緣靜脈快速推注碘海醇(300 mg/L)，總量2.0 ml/kg，注射速率1 ml/s(注射時間約4 s)，分別于對比劑注入后10 s(動脈期，arterial phase,AP)、20 s(靜脈期，venous phase,VP)及1 min(延遲期，lag phase,LP)行DESCT掃描，掃描野包括全腹部。

平掃及增強掃描獲得的各期單能圖像均傳至Advanced Workstation(ADW4.5，通用電氣公司， General Electric Company ，GE Health)工作站進行后期處理。在最佳KeV圖像上，記錄肝臟實質(zhì)感興趣區(qū)(region of interest, ROI)內(nèi)的各能譜參數(shù)，測得碘-水含量，并計算標準化碘含量(組織內(nèi)碘含量/同層面主動脈內(nèi)碘含量)。其中ROI的放置：選取肝門層面，將ROI(面積8～10 mm2)分別放置于肝右前葉、右后葉及左葉，避開血管及肝臟邊緣，各測量值取該3處的均值，并應用GE全肝體積快速測量軟件測量兔肝臟體積。

1.4 組織染色及病理分級CT檢查后4 h內(nèi)用過度麻醉處死模型組大白兔。取出肝臟用10%的中性福爾馬林固定。觀察肝臟外觀變化情況，行 HE Masson 及免疫組化( -sma 及 Col-) 染色， 鏡下觀察肝組織變化情況。按 2000 年 9 月西安第十次全國病毒性肝炎及肝病學術會議修訂的肝穿活檢病理判斷標準[5]，將纖維化從無到重分為 S0組(正常對照組)、S1～S3組(肝纖維化組)、S4組(肝硬化組)，評價其纖維化程度。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(ANOVA)計算S0～S4期各組能譜參數(shù)值及肝臟體積差異有無統(tǒng)計學意義，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大體表現(xiàn)正常兔的肝臟色澤均勻暗紅，表面光滑。CCl4給藥8周后可見兔肝臟充血、腫脹，包膜緊張，表面不光滑，見圖1A；給藥12周后兔肝臟顏色加深，體積縮小，觸及表面有顯著顆粒感，見圖1B。

圖1 CCl4給藥后肝臟大體形態(tài)A：給藥8周后；B：給藥12周后

2.2 鏡下表現(xiàn)正常對照組肝細胞呈放射狀排列，細胞分界清晰，匯管區(qū)結(jié)構清晰；胞質(zhì)染色均勻，未見脂肪變性。實驗組隨給藥時間延長，肝內(nèi)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維數(shù)量增多、范圍擴大，小葉間隔紊亂，肝細胞變性、壞死及炎細胞浸潤加重。見圖2A、2B。

圖2 正常肝小葉與給藥后肝小葉結(jié)構對比 HE×100A：S0期；B：肝纖維化S3期

2.3 DESCT增強掃描圖像分析結(jié)果對肝纖維化模型大白兔進行能譜CT掃描，對其CT值、碘值及NIC進行測定，見圖3A、3B、3C，并在三維圖像上測定肝臟體積，隨著肝纖維化程度的加重，AP及VP碘值、CT值及NIC下降，碘值及NIC組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各期CT值組間差異無統(tǒng)計學意義。S1～S2期肝臟體積較對照組腫大，S3～S4期隨肝纖維化程度加重，肝臟體積縮小，見圖4A、4B，且組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.4 病理結(jié)果根據(jù)病理檢查，動物實驗對照組10只均為S0期。實驗組分別為：4周組9只為S1期，1只死于麻醉意外；6周組3只S1期，7只S2期；8周組3只S2期， 6只S3期，1只死于肝功能衰竭；10周組：5只S3期，2只S4期，3只死于肝功能衰竭；12周組：6只S4期，4只死于肝功能衰竭；除9只實驗兔死亡外，其余S1期12只，S2期10只，S3期11只，S4期8只。

圖3 兔肝纖維化模型CT值、碘值及NIC進行測定A：單能量(70 keV)圖；B：碘基圖，測得相應區(qū)域碘值、NIC；C：各區(qū)域能譜曲線

表1 AP及VP兔肝臟(S0～S4)能譜參數(shù)、體積測量值及組間差異

與對照組比較：*P<0. 05，**P<0. 01

圖4 CT三維重建圖像上測得的肝臟體積A：S2期肝臟體積；B：S3期肝臟體積

3 討論

肝纖維化是肝細胞受到炎癥刺激或發(fā)生壞死時，肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的病理過程[6]。各種病因引起的慢性肝病絕大多數(shù)都有肝纖維化，如不及時診治，其中有25%～ 40%可以發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[7]。肝纖維化甚至早期肝硬化是可逆的，早期及時診斷并對肝纖維化進程予以干預可以扭轉(zhuǎn)甚至治愈肝纖維化[8]，因此尋找一種既方便安全，又能夠高效評估肝纖維化程度，還可以動態(tài)觀察疾病進展的檢查方法顯得尤為必要。由于肝纖維化、肝硬化發(fā)生發(fā)展過程與肝竇毛細血管化及血供改變密切相關，因此可以通過評價肝臟的血流改變情況來評價其纖維化程度[2]。

DESCT的多模態(tài)成像技術不僅能夠提供常規(guī)CT所具有的解剖形態(tài)圖，而且其物質(zhì)定量技術可用于客觀評價人體組織的血供狀況，大大提高了疾病診斷的敏感性及可靠性[9]。另外，單能量模式重建圖像顯著優(yōu)于常規(guī)混合能量模式重建圖像，在圖像的后期處理中能夠提供更多信息，可在臨床中常規(guī)運用[10]。本實驗通過制作的兔肝纖維化模型，應用GSI成像技術及物質(zhì)定量分析技術，測得肝組織經(jīng)DESCT動態(tài)增強掃描各期的CT值、碘含量及標準化碘含量，結(jié)果顯示S0～S4期肝臟有如下變化：在動脈期時，肝臟出現(xiàn)強化，CT值、碘值及NIC均上升；靜脈期，肝臟強化程度仍然有上升；但隨著肝纖維化程度的加重，AP及VP，CT值、碘值及NIC上升程度逐漸減弱；且各組間碘值及NIC差異存在顯著性，而CT值無顯著性差異。本實驗結(jié)果反映肝臟的血流量隨肝纖維化程度加重呈下降趨勢；DESCT物質(zhì)定量技術對碘物質(zhì)的測定比CT值能更精確地反映血流狀況的改變。

蘇李娜 等[11]研究表明，在肝纖維化、肝硬化過程中，從正常肝臟(S0)到輕度肝纖維化(S1～S2)肝體積逐漸增大；從重度肝纖維化(S3～S4)到晚期肝硬化肝體積減小。本組實驗通過美國通用電氣公司的全肝體積快速測量軟件測量兔肝臟體積結(jié)果顯示：S1～S2組，肝臟體積增大，S3～S4組，肝臟體積縮小，表面不光整，肝裂增寬；本組測量結(jié)果與大體標本所見一致，并與前述研究發(fā)現(xiàn)一致。

本實驗存在一定局限性：實驗對象為新西蘭大白兔，應用于臨床患者時，尚不能確定是否有相似的結(jié)果；且樣本量較少，還需加大樣本量觀察，以期為臨床應用提供可靠的實驗基礎。

總之，DESCT成像快速、便捷，具有強大的圖像后處理功能，尤其是物質(zhì)定量技術對碘值及NIC的測定，為評價兔肝纖維化模型的血流狀況變化提供了直觀精確的手段，可以對肝纖維化程度進行較好的評估；并可以直接顯示肝臟形態(tài)的改變；DESCT多模態(tài)成像技術可以為肝纖維化的分期提供影像支持。