盛 瑤，吳 成，李傳應(yīng)

食物過敏根據(jù)免疫機(jī)制的不同，可分為IgE或非IgE型[1]。IgE介導(dǎo)食物過敏主要涉及Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，非IgE介導(dǎo)的食物過敏主要涉及Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)和Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)(T細(xì)胞介導(dǎo))[2]。目前普遍認(rèn)為效應(yīng)性T細(xì)胞(effector T cells，Teffs)中輔助性T細(xì)胞(helper T cell，TH)亞群TH1/TH2失衡、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Tregs)功能紊亂是食物過敏重要分子機(jī)制之一。白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2)及其受體(interleukin-2 receptor，IL-2R)在調(diào)控Teffs及Tregs的功能中起到重要作用。IL-10主要由Tregs分泌，是一種免疫抑制因子，對(duì)食物過敏免疫耐受性至關(guān)重要[3-4]，目前上述細(xì)胞因子在不同免疫機(jī)制介導(dǎo)的食物過敏患兒體內(nèi)變化特點(diǎn)尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5]。該研究考察食物過敏患兒臨床特點(diǎn)及上述細(xì)胞因子水平，為進(jìn)一步探究不同免疫途徑介導(dǎo)的食物過敏相關(guān)消化道疾病的免疫學(xué)機(jī)制提供有價(jià)值的線索。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇安徽省兒童醫(yī)院消化內(nèi)科2017年12月～2018年6月臨床診斷為食物過敏患兒共52例為研究組，所有患兒通過飲食回避、母乳喂養(yǎng)患兒母親嚴(yán)格回避過敏食物或更換游離氨基酸配方粉后，食物過敏癥狀減輕或消失，再次進(jìn)食該食物，食物過敏癥狀再次出現(xiàn)，即食物回避-激發(fā)試驗(yàn)陽性[6]。另排除其他可引起消化道癥狀的原因，如先天性巨結(jié)腸、炎癥性腸病、麥克爾憩室等。根據(jù)患兒血清食物特異性IgE抗體水平高低，分為非IgE組(36例)及IgE組(16例)。同時(shí)選取2017年12月～2018年6月于安徽省兒童醫(yī)院體檢的15例健康兒童作為對(duì)照組。研究組與對(duì)照組在性別和年齡上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。該研究已通過安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，并與患兒家長簽署知情同意書。

表1 食物過敏患兒與對(duì)照組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1血細(xì)胞學(xué)檢測 取研究組患兒及正常對(duì)照組兒童外周靜脈血2 ml加入肝素抗凝管中，測定全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(complete blood count，CBC)與差分計(jì)數(shù)，以評(píng)估白細(xì)胞數(shù)(×109/L)、淋巴細(xì)胞數(shù)(×109/L)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(×109/L)、嗜酸性粒細(xì)胞比(%)、血紅蛋白(g/L)水平。

1.2.2細(xì)胞因子及受體檢測 使用西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的IMMULITE 1000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀定量檢測研究組患兒及正常對(duì)照組兒童血清中細(xì)胞因子IL-10、IL-2R及IL-8水平(化學(xué)發(fā)光法)，具體操作步驟參照IMMULITE 1000操作手冊(cè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備、設(shè)置、稀釋、校準(zhǔn)、測定和質(zhì)控程序。

1.2.3外周血單核細(xì)胞制備及RNA提取 取實(shí)驗(yàn)組患兒及正常對(duì)照組兒童外周靜脈血5 ml，肝素鈉抗凝，采用Ficoll密度梯度法分離血漿并提取外周血單核細(xì)胞，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為3×106個(gè)/ml。采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，利用PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)合成cDNA。引物序列由TAKARA公司合成。IL-10序列信息： 5′-ACATCAAGGCGCATGTGAAC-3′,5′-TA GAGTCGCCACCCTGATGT-3′; IL-2R序列信息：5′-GACAGGCCACACAGATGCTA-3′, 5′-GCTGGGATTC ACTCAGTTTGT-3′; IL-8序列信息：5′-CCACCGGAAGGAACCATCTC-3′；5′-TTCCTTGGGGTCCAGACAGA-3′；GAPDH序列信息：5′-TTCAACGGCACAGTCAAG-3′, 5′-CCAGCATCACCCCATTT-3′。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用SYBR?Premix Ex TaqTMII熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng), 具體步驟按照說明書進(jìn)行。利用Ct值計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量：ΔΔCt=(Ct病例組-CtGAPDH)-(Ct對(duì)照組-CtGAPDH)。病例組目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.2.5血清總IgE抗體及食物特異性IgE抗體檢測 使用西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的IMMULITE 2000 XPi全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀定量檢測研究組患兒血清中總IgE水平(化學(xué)發(fā)光法)，具體步驟參照IMMULITE 2000操作手冊(cè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備、設(shè)置、稀釋、校準(zhǔn)、測定和質(zhì)控程序。采用歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司生產(chǎn)的吸入性及食物性過敏原特異性IgE抗體檢測試劑盒(免疫印跡法)，在體外半定量檢測血清中特異性IgE抗體濃度。檢測項(xiàng)目：柳樹/楊樹/榆樹、普通豚草、艾蒿、屋塵螨/粉塵螨、屋塵、貓毛、狗上皮、蟑螂、點(diǎn)青霉/分枝孢霉/煙曲霉/交鏈孢霉、葎草、雞蛋白、牛奶、花生、黃豆、牛肉、羊肉、鱈魚/龍蝦/扇貝、蝦、蟹。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征非IgE組和IgE組食物過敏患兒均以消化道癥狀及濕疹為主要臨床表現(xiàn)，其中非IgE組患兒出現(xiàn)較多的臨床癥狀為腹瀉(58.33%)、血便(33.33%)和濕疹(55.56%)；IgE組患兒出現(xiàn)較多的臨床癥狀為腹瀉(68.75%)和濕疹(62.50%)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，非IgE組與IgE組患兒臨床癥狀發(fā)生率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 非IgE組與IgE組食物過敏患兒臨床特征比較[n(%)]

*采用χ2檢驗(yàn)，**采用校正χ2檢驗(yàn)，#采用Fisher精確概率法

2.2 血細(xì)胞學(xué)分類與對(duì)照組比較，非IgE組與IgE組患兒血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，非IgE組與IgE組比較，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而白細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞比例及血紅蛋白計(jì)數(shù)非IgE組、IgE組與對(duì)照組兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.3 血清細(xì)胞因子及受體水平比較非IgE組患兒血清IL-10水平和外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-10 mRNA水平顯著低于對(duì)照組和IgE組(P<0.05)，但I(xiàn)gE組IL-10血清水平和細(xì)胞mRNA水平與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。非IgE組和IgE組患兒血清IL-2R以及外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-2R mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，但非IgE組與IgE組IL-2R水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，非IgE組患兒血清IL-8水平和外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-8 mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而IgE組患兒IL-8水平與對(duì)照組、非IgE組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖1。

血細(xì)胞學(xué)分類非IgE組(n=36)IgE組(n=16)對(duì)照組(n=15)統(tǒng)計(jì)量值白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)9.62±2.6510.13±3.058.40±2.731.637淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)5.73±2.24?5.47±1.84?3.73±1.895.065嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)0.47±0.44?0.45±0.28?0.21±0.162.911嗜酸性粒細(xì)胞比例(%)3.65(3.20)4.22(5.10)3.20(2.20)3.433血紅蛋白計(jì)數(shù)(g/L)118.39±61.60111.25±12.10109.80±14.830.241

與對(duì)照組比較：*P<0.05

細(xì)胞因子非IgE組(n=36)IgE組(n=16)對(duì)照組(n=15)統(tǒng)計(jì)量值IL-10(ng/L)3.47(1.38)??#9.20(2.14)14.00(13.61)45.024IL-2R(IU/L)2 048.58±495.79?1 772.50±888.11?1 112.00±364.3513.332IL-8(ng/L)22.30(49.70)?15.10(10.10)13.20(9.20)7.726

與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與IgE組比較，#P<0.05

A：非IgE組、IgE組與對(duì)照組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-10 mRNA水平；B：非IgE組、IgE組與對(duì)照組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-2R mRNA水平；C：非IgE組、IgE組與對(duì)照組患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-8 mRNA水平；與對(duì)照組比較：#P<0.05,##P<0.01；與IgE組比較：*P<0.05

3 討論

研究[7-8]表明，IL-10血清濃度降低與食物過敏的高風(fēng)險(xiǎn)存在緊密聯(lián)系。牛奶蛋白過敏患兒游離氨基酸配方干預(yù)前血清IL-10水平比干預(yù)后顯著降低，提示牛奶蛋白過敏患兒體內(nèi)IL-10水平異常。根據(jù)本研究結(jié)果顯示，非IgE介導(dǎo)的食物過敏中，Tregs活性降低，其分泌IL-10等免疫抑制因子水平較低，不足以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致了口服免疫耐受缺陷，從而引起了一系列臨床癥狀，如腹瀉、血便等，而IgE介導(dǎo)的食物過敏主要涉及TH2型細(xì)胞因子如組胺、IL-4、腫瘤壞死因子α等為主導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)，與Tregs活性及IL-10水平高低關(guān)系不大。本研究還顯示，IgE組患兒血清IL-10水平顯著高于非IgE組，推測與體液免疫應(yīng)答中，IL-10能夠增強(qiáng)B細(xì)胞上II類表達(dá)并誘導(dǎo)免疫球蛋白的生成有關(guān)[9]。綜上考慮，檢測食物過敏患兒血清IL-10水平高低對(duì)于初步判斷食物過敏免疫類型具有一定的指向性意義。

IL-2結(jié)合IL-2R可激活三種不同的信號(hào)通路發(fā)揮作用[10]。IL-2與Teffs表面IL-2R結(jié)合可激活并誘導(dǎo)Teffs，并加強(qiáng)Teffs的殺傷作用(免疫激活)；IL-2與Tregs表面IL-2R結(jié)合是維持Tregs細(xì)胞存活及發(fā)揮作用的必要條件[11](維持免疫耐受)。本研究結(jié)果表明，IL-2和IL-2R信號(hào)通路在食物過敏中主要表現(xiàn)為免疫激活而非免疫耐受，推測與在IL-2R高表達(dá)條件下，Teffs處于高度活化狀態(tài)，可積極發(fā)揮免疫激活作用，而Tregs維持免疫耐受功能并不明顯有關(guān)，這與本研究中非IgE組患兒血清IL-10水平、IL-10 mRNA水平顯著低于對(duì)照組相一致。此外，食物過敏患兒血清IL-2R水平均顯著升高，表明檢測患兒血清IL-2R水平可作為快速明確食物過敏診斷的重要指標(biāo)之一。

Kimura et al[12]對(duì)食物蛋白誘導(dǎo)的小腸結(jié)腸炎患兒血清細(xì)胞因子進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，血清中IL-2、IL-5及IL-8水平顯著升高，提示IL-2、IL-5和IL-8參與了FPIES相關(guān)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，這與本研究中非IgE組IL-8水平、IL-8 mRNA水平顯著高于對(duì)照組相一致。然而，IL-8是一種強(qiáng)中性粒細(xì)胞趨化因子，其可趨化中性粒細(xì)胞定向游走到病灶并釋放一系列炎癥活性因子，通常認(rèn)為中性粒細(xì)胞浸潤是急性炎癥反應(yīng)的特征之一，目前食物過敏發(fā)病機(jī)制雖尚未完全闡明，但國內(nèi)外公認(rèn)食物過敏是免疫介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)，故而食物過敏并不支持急性炎癥反應(yīng)。因此，對(duì)于IL-8在食物過敏患兒血清水平的變化可能需要進(jìn)一步研究闡明。