袁 野，馬丹丹，張建新，鐘藍(lán)海，蕭正康，張智勇

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)簡(jiǎn)稱肝癌，是高度惡性的腫瘤[1]。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，肝癌發(fā)病率在全球位居男性癌癥第5位，女性癌癥第7位，死亡率在癌癥相關(guān)死因中位列第三[2-3]。肝癌5年生存率在過去10年沒有顯著提升，僅為10%[4]。大量增殖和侵襲轉(zhuǎn)移是肝癌患者病死率高及臨床療效差的關(guān)鍵，機(jī)制不明[5-6]。因此，探究肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)改善預(yù)后以及尋找肝癌診療靶點(diǎn)至關(guān)重要。Tang et al[7]報(bào)道134序列相似的家庭成員B (family with sequence similarity 134, member B, FAM134B)最早在食管鱗狀上皮癌中被發(fā)現(xiàn)，且與該腫瘤惡性表型有關(guān)。但關(guān)于FAM134B在肝癌中的作用和機(jī)制研究未見報(bào)道。該研究將以肝癌臨床標(biāo)本及相應(yīng)病例資料為基礎(chǔ)，探討FAM134B在肝癌中的表達(dá)及臨床意義，以期為尋找肝癌新的臨床診療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2016年1月～2017年12月在中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院接受手術(shù)治療的42例肝癌患者的組織標(biāo)本及臨床病理資料。本研究獲得該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。手術(shù)切除病變肝癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本后，立即置入液氮中保存。42例患者的臨床病理資料包括：性別、年齡、腫瘤數(shù)目、乙肝、肝硬化、血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、腫瘤大小、腫瘤包膜完整情況、衛(wèi)星灶、鄰近組織侵犯、門靜脈癌栓、肝外轉(zhuǎn)移、Child分級(jí)、BCLC分期等。

1.2 主要試劑FAM134B和GAPDH一抗及二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；TRIzol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；總蛋白抽提試劑盒、蛋白濃度檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)基、血清、胰酶均購(gòu)自日本Sigma公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司；HepG2細(xì)胞與L02細(xì)胞均保存于本院中心實(shí)驗(yàn)室液氮罐。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)FAM134B mRNA表達(dá)運(yùn)用TRIzol試劑盒提取mRNA、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，低溫保存?zhèn)溆?。Real-time PCR總反應(yīng)體系為20 μl，其中SYBR Green mix緩沖液10 μl，上下游引物各0.6 μl(濃度為10 μmol/L)，cDNA 2 μl。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。FAM134B與GAPDH引物見表1。

表1 Real-time PCR引物的基因序列

1.4 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定免疫組織化學(xué)染色按試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟操作，制作石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，抗原修復(fù)，F(xiàn)AM134B抗體(1 ∶1 000稀釋)孵育，二氨基聯(lián)苯氨(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片固定。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：未見陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞率<5%判定為陰性(-)，陽(yáng)性細(xì)胞率5%～25%定為弱陽(yáng)性(+)，25%～50%為中度陽(yáng)性()，>50%為強(qiáng)陽(yáng)性()。中度陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性均判定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 Western blot檢測(cè)FAM134B蛋白表達(dá)肝癌組織和癌旁組織分別稱重并切成小塊置于EP管(eppendorf管)中，EP管中加入含蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑，反復(fù)研磨組織，冰上裂解30 min，使組織盡可能完全裂解，得到裂解液；小心刮下L02細(xì)胞及HepG2細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至EP管中，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑，得到裂解液。將裂解液離心取上清液即得到蛋白樣品。二喹啉甲酸(BCA )法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白的分子量選擇相應(yīng)的分離膠和濃縮膠，以恒定電壓80 V行SDS-PAGE電泳分離。蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，F(xiàn)AM134B及GAPDH孵育一抗(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。孵育二抗 (1 ∶3 000稀釋), 室溫?fù)u床1 h，再次TBST洗膜3次，每次10 min.化學(xué)發(fā)光法曝光檢測(cè)。免疫印跡條帶的灰度值經(jīng)灰度掃描儀分析后獲得。

2 結(jié)果

2.1 IHC檢測(cè)FAM134B蛋白表達(dá)FAM134B在42例肝癌組織及癌旁組織均有表達(dá)，詳見圖1。依據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)AM134B在癌旁組織中為陰性、弱陽(yáng)性或中度陽(yáng)性，但在肝癌組織中為弱陽(yáng)性、中度陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)得FAM134B在肝癌組織及癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)率分別為83%(35/42)和33%(14/42)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.343，P<0.05)。

圖1 FAM134B在癌旁組織及肝癌組織中的表達(dá) DAB染色×200 A:癌旁組織；B:肝癌組織

2.2 Real-time PCR檢測(cè)FAM134B基因表達(dá)結(jié)果FAM134B在肝癌組織中的mRNA表達(dá)高于癌旁組織(t=22.084,P<0.05)。并且FAM134B在HepG2細(xì)胞中的mRNA表達(dá)高于L02細(xì)胞(t=19.985,P<0.05)，見圖2。

圖2 Real-time PCR檢測(cè)FAM134B的mRNA表達(dá)

與癌旁組織比較：*P<0.05；與L02細(xì)胞比較：#P<0.05

2.3 Western blot檢測(cè)FAM134B蛋白表達(dá)結(jié)果FAM134B蛋白在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)高于L02細(xì)胞，F(xiàn)AM134B在肝癌組織中的蛋白表達(dá)同樣低于癌旁組織。見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)FAM134B的蛋白表達(dá)

2.4 FAM134B蛋白表達(dá)水平與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系FAM134B蛋白表達(dá)量與腫瘤大小(t=1.089，P<0.05)、血清AFP(t=-7.273，P<0.05)、門靜脈癌栓(t=6.309，P<0.05)、肝外轉(zhuǎn)移(t=6.640，P<0.05)、鄰近器官侵犯(t=7.959，P<0.05)和分化程度(t=6.115，P<0.05)顯著相關(guān)，即FAM134B表達(dá)量增高時(shí)，腫瘤更大、AFP更高、鄰近器官侵犯更多、分化程度更低，且存在門靜脈癌栓和肝外轉(zhuǎn)移。然而與性別、年齡、乙肝、肝硬化、淋巴結(jié)侵犯無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。FAM134B在AFP表達(dá)水平正常的肝癌標(biāo)本中部分(42.86%，12/28)高表達(dá)。見表2。

表2 FAM134B蛋白表達(dá)量與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

FAM134B是一個(gè)相對(duì)較新的分子，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于FAM134B在人類疾病中的作用研究較少，2007年，Tang et al[7]發(fā)現(xiàn)FAM134B在食管鱗狀細(xì)胞癌中促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，表現(xiàn)為癌基因的特性。相反在2014年，相關(guān)研究[8-9]顯示FAM134B在結(jié)腸癌中抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為抑癌基因的特性。FAM134B在不同的腫瘤中發(fā)揮不同的作用激發(fā)了筆者極大的研究興趣。鑒于FAM134B在肝癌中發(fā)揮的作用及機(jī)制研究目前是空白的，且研究[10-11]表明FAM134B突變與癌癥患者臨床病理特征密切相關(guān)。因此本研究致力于研究FAM134B與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系，探討其臨床意義。

癌癥是由信號(hào)通路中的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的原癌基因與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和存活的抑癌基因失調(diào)而發(fā)展的細(xì)胞疾病[12]，原癌基因的異常表達(dá)或抑癌基因被抑制將導(dǎo)致癌癥進(jìn)展[13]。本研究中免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示FAM134B在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織。Real-time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果均顯示FAM134B在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于L02細(xì)胞?？梢?，F(xiàn)AM134B在肝癌中呈高表達(dá)，發(fā)揮癌基因特性。本研究結(jié)果與Tang et al[7]的報(bào)道一致，與Kasem et al[8]及Islam et al[9]的報(bào)道相反。

本研究通過統(tǒng)計(jì)分析FAM134B蛋白表達(dá)與42例肝癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系得出：FAM134B在肝癌組織中高表達(dá)與肝癌患者的性別、年齡、乙肝、肝硬化與淋巴結(jié)侵犯無(wú)明顯相關(guān)。但FAM134B表達(dá)量增高時(shí)，腫瘤更大、AFP更高、鄰近器官侵犯更多、分化程度更低。且存在門靜脈癌栓和肝外轉(zhuǎn)移的患者FAM134B表達(dá)量更高。結(jié)果提示FAM134B可能在肝癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的促進(jìn)作用。肝癌患者的預(yù)后與早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療有直接關(guān)系[3]。目前，AFP有助于篩查和早期診斷肝癌[14]，但AFP也有其局限性，即只有40%～60%的肝癌患者AFP增高，尚有部分肝癌患者的血清AFP水平并沒有顯著升高。如果這部分肝癌患者僅用AFP這一生化檢測(cè)指標(biāo)來(lái)篩查和早期診斷肝癌，則容易造成漏診。因此探索更多生物學(xué)指標(biāo)來(lái)增強(qiáng)肝癌早期診斷的精確性、靈敏度和特異度具有較大的臨床意義。本研究中，F(xiàn)AM134B在AFP表達(dá)水平正常的肝癌標(biāo)本中高表達(dá)，達(dá)42.86%。因此，本研究結(jié)果提示FAM134B可能是AFP陰性肝癌的潛在早期診斷指標(biāo)。