張 玉，張城城,2，董利菊，沙 泉

隨著惡性腫瘤發(fā)病率與死亡率的逐年增加，人類健康受到了嚴(yán)重威脅。肺癌已經(jīng)成為男性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。雖然肺癌的研究近年來(lái)已取得一定進(jìn)展，但是非小細(xì)胞肺癌(non-small lung cancer,NSCLC)發(fā)現(xiàn)時(shí)多已處于中晚期，5年生存率并未顯著提高[2]。白細(xì)胞介素35(interleukin-35，IL-35)是新發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素12(interleukin-12，IL-12)家族成員，由EB病毒誘導(dǎo)基因3(epstein-barr virus-induced gene 3，EBI3)和P35組成的異源二聚體，主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)[3]。研究[4-6]顯示，IL-35在肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移。但I(xiàn)L-35在NSCLC中的表達(dá)情況知之甚少。該研究擬通過(guò)分析IL-35在NSCLC中的表達(dá)和與患者預(yù)后的關(guān)系，以及對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，闡明IL-35在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的可能作用，為肺癌的靶向治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普胸外科2015年1～12月的74例NSCLC患者石蠟包埋的肺癌組織，被研究者臨床資料完整，手術(shù)前均未行放化療。NSCLC患者男47例，女27例；年齡43～84(61.31±8.49)歲，其中腺癌41例，非腺癌33例。根據(jù)國(guó)際肺癌TNM標(biāo)準(zhǔn)分期：T1+T2者55例，T3+T4者19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N0+N1者54例，N2+N3者20例：遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 M0者65例，M1者9例。選擇同期入院治療的肺部良性病變患者石蠟包埋的肺組織25例，設(shè)為對(duì)照組，男14例，女11例；年齡21～68(45.92±15.06)歲，其中肺大皰7例，硬化性血管瘤5例，錯(cuò)構(gòu)瘤4例，支氣管擴(kuò)張4例，其他5例。

1.2 主要試劑免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自臺(tái)灣GeneMark生物公司；逆轉(zhuǎn)錄及SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自南京Vazyme公司；人肺腺癌細(xì)胞株A549、NCI-H1975和PC-9為本單位免疫學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室保存；正常人腎上皮細(xì)胞HEK293由安徽醫(yī)科大學(xué)寄生蟲(chóng)學(xué)教研室饋贈(zèng)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自以色列BI公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；CCK-8購(gòu)自上海貝博生物公司；IL-35的亞基EBI3和P35抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；人重組IL-35蛋白購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化法檢測(cè)IL-35兩個(gè)亞基在NSCLC組織中的表達(dá) 采用SP法，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。首先組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精(100%、95%、75%)水化。檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)于高壓鍋中加熱煮沸，放入切片，蓋上壓力氣閥至噴氣后1～3 min進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS沖洗，然后一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色沖洗。最后蘇木精復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片，鏡檢并拍照記錄。免疫組化結(jié)果判斷：本實(shí)驗(yàn)采用許良中 等[7]的方法，根據(jù)細(xì)胞著色程度和陽(yáng)性細(xì)胞占觀察細(xì)胞百分比的評(píng)分乘積進(jìn)行半定量。隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按著色程度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽(yáng)性細(xì)胞占觀察細(xì)胞百分比評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～2分為陰性(-)，3～5分為弱陽(yáng)性(+)，6～8分為中度陽(yáng)性()，>8分為強(qiáng)陽(yáng)性()。其中-定義為蛋白陰性，+～定義為蛋白陽(yáng)性。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2、相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，若為單層緊密狀態(tài)時(shí)，用EDTA-胰蛋白酶消化，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中IL-35亞基表達(dá)水平 分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、NCI-H1975、PC-9和HEK293細(xì)胞，提取總RNA作為模板并逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA進(jìn)行RT-PCR。EBI3：上游引物：5′-CCTTCATTGCCACGTACAGG-3′，下游引物：5′-GGGCTTGATGATGTGCTCTG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為206 bp；P35：上游引物： 5′-TCAGAATTCGGGCAGTGACT-3′，下游引物： 5′-AGTCCCATCCTTCTTTCCCC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為163 bp。內(nèi)參為β-actin,PCR反應(yīng)預(yù)變性溫度：95 ℃、5 min,1個(gè)循環(huán)。循環(huán)反應(yīng)溫度:95 ℃,10 s;60 ℃,30 s,40個(gè)循環(huán)。溶解曲線溫度:95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s，1個(gè)循環(huán)。

1.3.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞：每100 μl細(xì)胞數(shù)為2 000～5 000個(gè)，加入到96孔板中，待細(xì)胞貼壁，分別用2、10、50 ng/ml的IL-35刺激48 h后，每孔中加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h，于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值。

1.3.5劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力 劃痕實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，胰酶消化，在6孔板中加入5×105個(gè)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌槍頭緩慢劃痕，用PBS清洗細(xì)胞2～3次去除浮起的細(xì)胞。對(duì)照組加入含0.5%血清的DMEM培養(yǎng)基，IL-35組在加入含0.5%血清的DMEM培養(yǎng)基的同時(shí),加入50 ng/ml的IL-35,放入37 ℃培養(yǎng)，按0、12、24 h取樣，拍照。Transwell實(shí)驗(yàn)：A549細(xì)胞用50 ng/ml的IL-35刺激24 h后，胰酶消化制成5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。在小室上層加入20 μl Matrigel覆蓋整個(gè)聚碳酸酯膜后自然晾干。下層加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基600 μl,上層加入200 μl不含血清的A549細(xì)胞懸液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15～20 min，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

圖1 NSCLC和肺部良性病變組織中EBI3和P35的表達(dá)

2 結(jié)果

2.1 IL-35在NSCLC組織中的表達(dá)免疫組化連續(xù)切片法染色結(jié)果顯示，NSCLC組織中EBI3和P35的表達(dá)水平明顯高于肺部良性病變者(圖1)，且EBI3和P35在空間分布和表達(dá)水平上有很強(qiáng)的相關(guān)性(rs=0.770,P<0.001)，見(jiàn)表1，所以這兩者的表達(dá)可以代表IL-35的表達(dá)水平，將IL-35表達(dá)定義為EBI3和P35都為(/)，其余情況為IL-35不表達(dá)。免疫組化結(jié)果表明NSCLC組織中可能高表達(dá)IL-35。統(tǒng)計(jì)分析顯示，IL-35表達(dá)與腫瘤T分期(χ2=5.129，P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=8.761，P<0.01)呈正相關(guān)性，與患者性別(χ2=0.667，P>0.05)、年齡(χ2=0.746，P>0.05)、組織類型(χ2=1.66，P>0.05)、分化程度(χ2=0.688，P>0.05)及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(P>0.05)等無(wú)相關(guān)性(表2)，以上結(jié)果提示：IL-35可能是肺癌的潛在標(biāo)志物。

表1 IL-35兩個(gè)亞基在74例NSCLC中表達(dá)的相關(guān)性

*采用Spearman相關(guān)性分析

表2 IL-35表達(dá)與NSCLC病理特征的相關(guān)性(n)

2.2 IL-35亞基在肺癌細(xì)胞和HEK293中的表達(dá)以人腎上皮細(xì)胞HEK293為對(duì)照，通過(guò)RT-PCR法檢測(cè)IL-35亞基EBI3和P35在不同肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。結(jié)果顯示，IL-35亞基在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H9175、PC-9中的表達(dá)水平與人正常細(xì)胞HEK293細(xì)胞有差異(圖2)，表明IL-35可能在肺癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

圖2 EBI3和P35在不同肺癌細(xì)胞系和正常細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 IL-35對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖的影響鑒于IL-35在A549細(xì)胞中表達(dá)量最高，且易培養(yǎng)，因此選擇A549細(xì)胞作為后續(xù)研究對(duì)象。不同濃度的人重組外源性IL-35蛋白作用于A549細(xì)胞48 h后，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)顯示，50 ng/ml的IL-35可明顯促進(jìn)A549肺癌細(xì)胞的增殖,與0 ng/ml比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見(jiàn)圖3。

圖3 不同濃度IL-35對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

2.4 IL-35對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響采用劃痕實(shí)驗(yàn)于0、12、24 h分別檢測(cè)50 ng/ml的IL-35對(duì)A549細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果顯示，IL-35具有一定的促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移的能力，與對(duì)照組比較，24 h后劃痕相對(duì)寬度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖4A、4B。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-35具有一定的促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲的作用，與對(duì)照組比較，IL-35組侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4C、4D。由此可推測(cè)IL-35可明顯促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移和侵襲。

3 討論

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。肺癌好發(fā)于支氣管黏膜上皮，病因至今尚不完全明確。隨著醫(yī)療水平的提高，肺癌的治療方法日益豐富，已發(fā)展成為手術(shù)為主，放療、化療和免疫治療等治療手段為輔的綜合性治療，但NSCLC確診時(shí)多已屬于晚期，總體預(yù)后情況仍不容樂(lè)觀[8-9]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，基因治療已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)，而尋找有效的靶基因尤為重要。研究證實(shí)，白細(xì)胞介素能影響包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的增殖、成熟、黏附及轉(zhuǎn)移等多方面生理過(guò)程。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-12對(duì)肝癌、腎細(xì)胞癌等多種癌癥具有防治效果，可增強(qiáng)免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤作用[10]。

IL-35是IL-12家族的最新成員，主要由Treg細(xì)胞分泌，在單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等多種類型細(xì)胞上表達(dá)，通過(guò)激活JAK-STAT信號(hào)通路參與免疫功能的調(diào)節(jié)，除了直接抑制腫瘤微環(huán)境的腫瘤免疫狀態(tài)，引起免疫逃逸，IL-35還能直接作用于某些腫瘤細(xì)胞促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[11]。Wang et al[12]研究發(fā)現(xiàn)，IL-35在B細(xì)胞淋巴瘤、黑色素瘤及鼻咽癌等多種腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中都有表達(dá)。有研究[13]證實(shí)IL-35在急性髓系白血病中，除了能誘發(fā)腫瘤的免疫逃逸機(jī)制外，也能直接促進(jìn)腫瘤增殖及抑制腫瘤凋亡。一項(xiàng)NSCLC研究[14]顯示，NSCLC患者血漿IL-35水平較正常對(duì)照人群明顯升高，且血漿IL-35高表達(dá)水平與較差的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，單因素及多因素分析顯示血漿IL-35是NSCLC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。由此可見(jiàn)，IL-35可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖4 IL-35對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響

A:顯微鏡下細(xì)胞遷移能力的差異×50；B：劃痕愈合的相對(duì)定量分析；與對(duì)照組比較：***P<0.001；C: 顯微鏡下細(xì)胞侵襲能力的差異×100；D：細(xì)胞侵襲數(shù)目的定量分析；與對(duì)照組比較：**P<0.01

本研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)NSCLC患者和對(duì)照組組織中IL-35的表達(dá)水平，結(jié)果顯示NSCLC患者組織中IL-35的表達(dá)明顯高于肺部良性病變患者，初步表明IL-35在NSCLC患者組織中異常高表達(dá)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析74例NSCLC患者組織中IL-35表達(dá)差異與臨床病理特征之間的相關(guān)性得出：IL-35表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性, 與患者性別、年齡、組織類型、分化程度及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等均無(wú)相關(guān)性，而復(fù)發(fā)和早期轉(zhuǎn)移是NSCLC預(yù)后不良的主要因素，說(shuō)明IL-35的高表達(dá)水平和患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示其可能影響NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。接著通過(guò)體外細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人重組IL-35蛋白能明顯促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，表明IL-35在NSCLC中可能是一種新的促癌不良因子，參與肺癌的不良進(jìn)程。因此，IL-35可以作為一個(gè)新的有效的治療靶點(diǎn)，應(yīng)用于臨床和靶向藥物的研發(fā)。

綜上所述，IL-35在NSCLC中高表達(dá)，并促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲，為深入研究IL-35對(duì)腫瘤的作用提供了線索，IL-35可能是一種NSCLC診斷和預(yù)后判斷的新型標(biāo)志物，但是IL-35發(fā)揮促癌作用的具體分子機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。