何俊飛,陳 炯, 胡丕波,鄔高華,周海波

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是一類致命的惡性腫瘤，其預(yù)后較差。由于早期缺乏臨床癥狀，多數(shù)患者確診后已進入晚期階段，放化療效果不佳。具有針對性治療方案甚少，早期確診后根治性手術(shù)切除是提高患者生存期最有希望的一種治療方法。CA199是一種黏蛋白型糖類腫瘤標志物，是目前臨床上診斷PDAC應(yīng)用最廣泛血清腫瘤標志物，但是急性胰腺炎、膽石癥、急性肝炎、肝硬化等良性疾病患者中CA199的水平也會升高，診斷效果較差。因此尋找適合的腫瘤標志物對PDAC的診斷預(yù)后具有重要意義。B淋巴細胞瘤2蛋白家族(B cell lymphoma-2，Bcl-2)是調(diào)節(jié)細胞凋亡的一組蛋白，Bcl-2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(Bcl-2 associated transcription factor 1，BCLAF1)是其家族成員之一，最初在篩選與腺病毒蛋白結(jié)合的相關(guān)蛋白中被鑒定出來[1]，過度表達能誘導(dǎo)細胞凋亡。然而關(guān)于BCLAF1與PDAC的關(guān)系研究甚少。該研究探討B(tài)CLAF1在PDAC中的表達情況并分析其兩者的關(guān)系，對研究PDAC的發(fā)生進展機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料研究選取安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2014年1月～2017年12月經(jīng)根治性手術(shù)而且病理診斷確診的67例 PDAC患者的腫瘤組織石蠟切片作為實驗組，對照組為相應(yīng)距離腫瘤組織邊緣>2 cm的癌旁組織，患者術(shù)前均未進行放化療，且臨床資料完整。其中男34例，女33例；年齡<60歲21例，>60歲46例；胰頭癌47例，胰尾癌20例；高分化12例，中低分化55例；直徑<20 mm有49例，>20 mm有18例；神經(jīng)侵犯32例，未侵犯35例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，未轉(zhuǎn)移22例；TNM分期I期22例，II期45例。人胰腺癌細胞系Panc-1購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 主要試劑RNA提取試劑 TRIzol購自美國Invitrogen公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、ECL超敏發(fā)光試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；BCLAF1一抗(稀釋比1 ∶1 000)購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔及羊抗鼠二抗和免疫組化通用型試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；pcDNA3.1-BCLAF1、pcDNA3.1-NC對照質(zhì)粒購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1BCLAF1細胞水平檢測

1.3.1.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染處理 將胰腺腺癌細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的Panc-1細胞并分為實驗組和對照組，消化、離心后接種于6孔板; 細胞融合達60%～70%時更換培養(yǎng)液，實驗組和對照組采用LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體試劑盒轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BCLAF1及pcDNA3.1-NC對照質(zhì)粒序列，轉(zhuǎn)染后24 h進行后續(xù)實驗。

1.3.1.2細胞侵襲實驗 Matrigel膠4 ℃過夜融化成液態(tài)后與DMEM 培養(yǎng)基按1 ∶9比例稀釋，均勻涂布于Transwell小室濾膜的上表面，37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。每室加入50 μl DMEM 培養(yǎng)基孵育1 h，吸棄培養(yǎng)液。取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h的細胞，胰酶消化并收集細胞，DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)調(diào)整細胞密度。將單細胞重懸液各取200 μl加入上室，下室中加入600 μl含30%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。取出小室，吸去上室的培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗 3次，用消毒濕棉簽輕輕擦凈上室未侵襲細胞及Martrigel膠，95%酒精固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，自來水沖洗3次以上，晾干。20倍光學(xué)顯微鏡下觀察，計數(shù)每個視野的侵襲細胞數(shù)，計算平均值。

1.3.1.3CCK-8法檢測Panc-1轉(zhuǎn)染細胞的增殖能力 將PANC-1細胞稀釋至1×107個/ml，接種至96孔板，200 μl/孔，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁3 h。將細胞分為3組：轉(zhuǎn)染BCLAF1質(zhì)粒組、nc陰性對照組、con未轉(zhuǎn)染組，每組均設(shè)6個復(fù)孔。每24 h取出96孔板，于顯微鏡下觀察，并加入CCK-8試劑，孵育1 h；用酶標儀檢測A450值，連續(xù)測定6 d并記錄結(jié)果。

1.3.2BCLAF1組織水平檢測

1.3.2.1qRT-PCR 稱取PDAC組織及癌旁正常組織各50 mg，剪碎組織添加液氮研磨，將研磨后的組織中加入1 ml TRIzol后離心以去除雜物碎片組織。采用 TRIzol試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測，計算總RNA純度并定量，電泳檢測總RNA的完整性。以1 μl總RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的流程進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，并以此為模板， 根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書配制PCR體系進行反應(yīng)。反應(yīng)條件:95 ℃變性5 min;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個循環(huán)。BCLAF1引物序列上游為: 5′-AAGGTCTGGGTCTGGTTCTG-3′，下游為:5′-GAGCATTCTGTGGTGCGATT-3′，產(chǎn)物大小122 bp；內(nèi)參照為GAPDH，F(xiàn)：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，R：5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′，產(chǎn)物大小180 bp。

1.3.2.2Western blot 取約50 mg組織標本，應(yīng)用裂解液提取組織總蛋白。離心后收集上清液，加入上樣緩沖液(按1份蛋白樣品 ∶5份緩沖液比例進行)，100 ℃加熱10 min。冷卻后加樣孔內(nèi)，100 V電泳約1 h。取出凝膠，4 ℃、40 V電轉(zhuǎn)印2 h至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。加入1 ∶1 000的稀釋一抗體孵育過夜。加入1 ∶5 000稀釋的二抗，孵育2 h；加入ECL曝光顯影約5 min，觀察、成像。軟件分析平均光密度值。

1.3.2.3IHC 石蠟包埋4 μm連續(xù)切片后置于載玻片，在pH 6的環(huán)境中微波處理消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，再向切片上滴加3%H2O2和山羊血清等待20 min以封閉非特異性蛋白并，然后滴加一抗稀釋液(1 ∶200)4 ℃過夜，復(fù)溫后加入二抗，顯微鏡下滴加DAB液顯色，觀察。最后蘇木精復(fù)染，酒精脫水、甲醛透明封片。BCLAF1主要定位于PDAC細胞的細胞核中，評估標準采用半定量。隨機選取5個高倍鏡視野下進行陽性百分比評分，無細胞著色計0分、1%～10%細胞著色計1分、11% ～50%細胞著色計2分、>50%細胞著色計3分。根據(jù)染色程度棕黃色、黃色、淡黃色、未著色分別計為3、2、1、0分，所有切片由兩名病理科醫(yī)師分析，每張切片的最終得分為兩項結(jié)果的乘積，≥4分的為陽性。

2 結(jié)果

2.1 Transwell侵襲實驗結(jié)果Transwell實驗結(jié)果顯示：Panc-1細胞中BCLAF1的過表達明顯增強了PDAC細胞的侵襲遷移能力。光學(xué)顯微鏡下觀察未轉(zhuǎn)染組細胞數(shù)(96.15±9.91)，空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細胞數(shù)(98.40±5.94)，BCLAF1-轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組細胞數(shù)(159.80±15.3)。見圖1。

2.2 Panc-1轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BCLAF1質(zhì)粒的細胞增殖實驗結(jié)果由圖2可知：此為PANC-1轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BCLAF1質(zhì)粒的細胞增殖實驗，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BCLAF1質(zhì)粒的PANC-1細胞增殖曲線增高。

圖1 Transwell侵襲實驗 A:PANC-1細胞的未轉(zhuǎn)染組；B:空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；C:BCLAF-1轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組

圖2 CCK-8細胞增殖實驗

2.3 qRT-PCR檢測結(jié)果檢測10例配對的PDAC組織及癌旁組織中BCLAF1的mRNA表達，BCLAF1 mRNA的平均表達量范圍分別為(0.41～1.94)、(0.09～1.00)。PDAC組BCLAF1 mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.37,P=0.0034)。見圖3。

圖3 PDAC組、癌旁正常胰腺組中BCLAF1的mRNA表達水平A：PDAC組；B：癌旁正常胰腺組；與癌旁正常胰腺組比較：**P<0.01

2.4 Western blot檢測BCLAF1的表達情況分別檢測PDAC及癌旁組織各10 例，有8例(80%)癌組BCLAF1的表達明顯高于癌旁組，癌組BCLAF1平均灰度值為(1.451±0.068)，顯著高于癌旁組(0.757±0.048)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.323，P<0.001)。見圖4。

圖4 PDAC組、癌旁正常組中BCLAF1的表達水平A：PDAC組織；B：癌旁正常胰腺組織

2.5 PDAC以及癌旁組織中BCLAF1的表達檢測67例PDAC及相配對的癌旁組織，結(jié)果顯示BCLAF1主要表達于PDAC導(dǎo)管細胞的細胞核中，正常胰腺組織中的陽性表達比例明顯低于BCLAF1在PDAC中的陽性表達，PDAC組BCLAF1陽性表達的有47例(78.33%)，高于癌旁組織組(35.82%)，差異統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=27.610，P<0.001)。見表1、圖5。

表1 BCLAF1蛋白在PDAC組織和癌旁正常組織中的表達(n)

圖5 BCLAF1在PDAC組織和癌旁正常胰腺組織中的表達 × 400A：PDAC組織；B：癌旁正常胰腺組織

2.6 BCLAF1與PDAC患者臨床病理資料間的關(guān)系IHC顯示：BCLAF1的表達與PDAC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期顯著相關(guān)(P<0.001)。見表2。

表2 BCLAF1表達與PDAC臨床病理特征的相關(guān)性(n)

2.7 BCLAF1表達與患者預(yù)后關(guān)系Kaplan-Meier生存分析顯示，隨著時間推移生存率明顯下降，BCLAF1高表達的下降趨勢比BCLAF1低表達更為顯著。BCLAF1高表達的總生存期(overall survival,OS)和無病生存期(disease-free survival,DFS)都明顯縮短，經(jīng) Log-Rank 檢驗顯示：BCLAF1高表達者與低表達者生存率相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖6。單因素和多因素分析結(jié)果顯示:BCLAF1高低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TMN分期為影響PDAC患者生存時間的獨立因素。見表3、4。

表3 PDAC患者生存時間的單因素分析

3 討論

PDAC是惡性程度最高的消化道腫瘤之一。 近幾年發(fā)病率迅速上升，因其早期癥狀不明顯、診斷手段缺乏、腫瘤標志物特異性差，大部分患者就診時已出現(xiàn)局部侵襲甚至遠處轉(zhuǎn)移, 失去了最佳的治療時機, 晚期對放化療的敏感性較低。 因此,探究調(diào)控PDAC發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移的分子靶點, 尋找有效的用于早期診斷及治療的生物標志物是亟待解決的關(guān)鍵問題。

表4 PDAC患者生存時間的多因素分析

圖6 PDAC中BCLAF1低表達、高表達患者生存曲線A:OS ; B:DFS

BCLAF1是一種富含精氨酸-絲氨酸的RS結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[2]，該蛋白基因位于染色體6q22-23的區(qū)域，該區(qū)域基因的缺失可能與癌癥的發(fā)生有關(guān)。近年來由于對BCLAF1研究熱度和深度的增加，文獻報道細胞表面BCLAF1通過調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工參與調(diào)節(jié)細胞凋亡、DNA損傷應(yīng)答、分化等過程，在個體發(fā)育、癌癥及其他疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。Zhou et al[3]研究結(jié)直腸癌組織發(fā)現(xiàn)BCLAF1可變剪接的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生兩種蛋白:全長型(L型)和截短型(T型)，不同蛋白亞型在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用也不同，在結(jié)腸癌細胞系中普遍存在L型。過表達BCLAF1-L可以在一定程度提高結(jié)腸癌細胞的克隆能力，進一步確證了其在結(jié)腸癌細胞中的促癌功能。Chen et al[4]對72例Ⅱ～Ⅱ期食管鱗狀細胞癌的患者實施同步化放療，由于食管鱗狀細胞癌的放化療容易導(dǎo)致局部腫瘤復(fù)發(fā)。隨后24個月內(nèi)，有49例確診為局部復(fù)發(fā)PCR顯示患者組織中BCLAF1上調(diào)，上調(diào)超過兩倍的患者占84.2%，其多因素分析BCLAF1的上調(diào)與早期局部復(fù)發(fā)獨立相關(guān)。本研究多因素分析結(jié)果顯示BCLAF1高低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TMN分期均為影響PDAC患者生存時間的獨立因素，表明BCLAF1 PDAC預(yù)后密切相關(guān)。Shen et al[5]通過GEO數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)BCLAF1與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3相關(guān)。SMYD3的表達增加膀胱癌細胞BCLAF1水平，而SMYD3的敲低抑制癌細胞中BCLAF1的表達。體內(nèi)測定顯示77%膀胱癌組織中BCLAF1的表達水平比鄰近正常對照組顯著上調(diào)，BCLAF1是一種細胞自噬誘導(dǎo)因子，敲低膀胱癌細胞中BCLAF1可抑制SMYD 3激活的細胞自噬，也抑制SMYD3誘導(dǎo)的細胞增殖和侵襲，對維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及阻止惡性腫瘤進展有重要意義。骨髓瘤的研究[6]表明，BCLAF1和caspase-10可能參與骨髓瘤細胞的共同調(diào)節(jié)途徑。caspase-10敲低后BCLAF1誘導(dǎo)蛋白在數(shù)量上大于BCLAF1 mRNA，表明caspase-10可能在轉(zhuǎn)錄后控制BCLAF1。抑制caspase-10后，BCLAF1與Bcl-2結(jié)合增加，Bcl-2通過釋放beclin-1引發(fā)骨髓瘤細胞自噬，表明BCLAF1可取代Beclin-1與Bcl-2結(jié)合，釋放出更多的Beclin-1促進自噬。BCLAF1與各種腫瘤關(guān)系密切相關(guān)，其過表達可促進細胞增殖克隆，發(fā)揮促瘤作用。但是國內(nèi)外關(guān)于BCLAF1在PDAC細胞的定位以及病理生理功能報道不多。本研究結(jié)果顯示BCLAF表達顯著高于癌旁組織。免疫組化結(jié)果顯示BCLAF1在PDAC細胞核中強陽性表達，進一步分析其與患者臨床資料的數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)與PDAC分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、等病理相關(guān)因素有密切關(guān)系，與以上研究結(jié)果均發(fā)現(xiàn)BCLAF1蛋白在多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到正性上調(diào)作用。IHC切片檢測有助于評估病情進展，有潛力成為早期PDAC篩查的腫瘤標志物。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BCLAF-1質(zhì)粒Panc-1細胞增殖速度，侵襲能力得到提高。這些都是與惡性腫瘤密切相關(guān)的常見表型，表明BCLAF1作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在PDAC中發(fā)揮著促癌作用。

BCLAF1與化療藥物對腫瘤的影響密切相關(guān)。直腸癌的研究[7]顯示BCLAF1在直腸癌細胞中定位以核分布為主，少量在胞質(zhì)，但正常的直腸黏膜中BCLAF1只定位于細胞核；同樣本研究免疫組化結(jié)果顯示BCLAF1在PDAC細胞核中強陽性，癌旁正常組織細胞核弱表達。接受新輔助療法后直腸癌組織中細胞核和胞質(zhì)中的BCLAF1表達顯著上調(diào)，生存率提高，而BCLAF1表達陰性和弱表達與預(yù)后不良獨立相關(guān)。本研究Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)BCLAF1高表達OS和DFS都明顯縮短。這可能由于腫瘤細胞中BCLAF1低表達抑制細胞凋亡，同時也抑制細胞自噬所引起。Dell′Aversana et al[8]研究表明急性髓性白血病細胞U937中過表達BCLAF1則會加快細胞生長速度，并降低細胞對抗癌藥組蛋白去乙?；敢种苿?SAHA)的敏感。敲低 BCLAF1增加細胞對SAHA 的敏感，抑制細胞增殖。用組蛋白去乙?；敢种苿?MS275處理增強miR-194-5p的表達后，導(dǎo)致U937細胞核內(nèi)BCLAF1出核且誘導(dǎo)細胞分化。這表明不僅BCLAF1表達水平會影響藥物對腫瘤的治療效果,其細胞亞定位也影響著藥物的療效。Shao et al[9]研究用化療藥阿霉素處理乳腺癌及結(jié)腸癌細胞使癌細胞衰老，發(fā)現(xiàn)BCLAF1通過NF-κB途徑上調(diào)，放大衰老信號，導(dǎo)致腫瘤生長抑制。其在非藥物處理組中敲低的BCLAF1對癌細胞生長同樣有明顯抑制，表明了BCLAF1對腫瘤的生長起到了一定的促進作用，但其機制與上調(diào)BCLAF1促進化療藥物對腫瘤的抑制作用不同。

本研究前期臨床樣本量規(guī)模較小，僅對PDAC組織中BCLAF1在PDAC中的作用做了初步探討，結(jié)果表明BCLAF1異常與PDAC發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可能參與了癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，促進細胞增殖克隆，有利于腫瘤形成。后續(xù)將進一步擴大樣本量研究，同時進行動物實驗以及藥物實驗驗證。