焦 敏，李 敏，萬(wàn)凱華，楊 勁，李 巖

通常把氘體積分?jǐn)?shù)低于0.015%(150 ppm)的水稱(chēng)為低氘水( deuterium depleted water, DDW)[1]。自然界中的生物，其氘含量并不是個(gè)定值，范圍約從 120～160 ppm，自然界中的DDW主要存在于冰川中，喜馬拉雅冰川水氘含量約為 130 ppm。自然界的水中氘的含量約為 150 ppm[2]。1990 年匈牙利國(guó)立研究所報(bào)道 DDW 能誘導(dǎo)寵物貓和狗自發(fā)性惡性腫瘤完全或部分消退[3]，并注冊(cè)申請(qǐng)其為動(dòng)物臨床抗腫瘤藥物。俄羅斯醫(yī)學(xué)科學(xué)院癌癥科研所與醫(yī)學(xué)生物問(wèn)題研究所進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[4-5]表明，長(zhǎng)期飲用DDW可在一定程度上延長(zhǎng)動(dòng)物的壽命。Tyrysov et al[6]研究結(jié)果也得出，飲用氘含量低的水能顯著減小鼠肺癌細(xì)胞移植瘤體積并延長(zhǎng)宮頸癌移植小鼠的壽命。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的級(jí)聯(lián)式基因表達(dá)過(guò)程，而半胱天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine protease protein,Caspase-3)蛋白是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的核心調(diào)控蛋白[7]，其表達(dá)水平的高低與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，該文通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究DDW對(duì)肺癌細(xì)胞A549體外增殖抑制作用，觀察處理后細(xì)胞的抑制率、細(xì)胞凋亡變化、檢測(cè)凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)水平，為今后DDW保健用品的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料DDW(體積分?jǐn)?shù)為0.005%)購(gòu)自新疆阿克特冰泉科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基粉末購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；CCK-8試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；抗體Caspase-3購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Techonlogy；ECL顯色試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液、5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。DDW實(shí)驗(yàn)組50、75、100 ppm，對(duì)照組為正常 RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞。

1.3 CCK-8法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖活性用CCK-8試劑盒對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行測(cè)定肺癌細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板中，24 h培養(yǎng)后，棄去原來(lái)培養(yǎng)基，加入由DDW配制的培養(yǎng)基，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后，每孔分別加入10 μl CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)3 h，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行選擇490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，測(cè)定各孔的光密度(optical denisity，OD)值。結(jié)果取3次實(shí)驗(yàn)平均值。計(jì)算DDW對(duì)細(xì)胞的抑制率，抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡將肺癌細(xì)胞A549接種于6孔板，每孔接種細(xì)胞1×104/ml。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的DDW (實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的DDW 50、75、100 ppm配制的培養(yǎng)基。對(duì)照組為正常 RPMI 1640配制的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，將細(xì)胞重懸于1×結(jié)合緩沖液中使細(xì)胞濃度為1×106/ml。吸取100 μl細(xì)胞懸液于5 ml培養(yǎng)管中，加入5 μl PE+5 μl 7-AAD 后渦旋細(xì)胞，在室溫黑暗處孵育15 min。每孔加入400 μl 1×結(jié)合緩沖液吹打收集的細(xì)胞后過(guò)200目尼龍篩，1 h內(nèi)測(cè)定熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 RT-PCR檢測(cè)Caspase-3基因表達(dá)

1.5.1總RNA提取 將肺癌細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種細(xì)胞1×104/ml。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的DDW (實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的DDW 50、75、100 ppm配制的培養(yǎng)基。對(duì)照組為正常 RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄去培養(yǎng)基，加PBS清洗3次。每個(gè)孔各加入1 ml TRIzol靜置30 min后用槍頭混勻吹打，吸至無(wú)RNase酶的EP管中，加入氯仿0.2 ml輕微震蕩15 s后，靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min后，取上清液。加入0.5 ml異丙醇，輕輕混勻后靜置10 min，4 ℃、 12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入1 ml 75%乙醇(應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用)洗滌沉淀，4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清液。室溫干燥15 min后，加入20 μl無(wú)RNase酶的無(wú)菌水，立即測(cè)定RNA濃度。

1.5.2逆轉(zhuǎn)錄 用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，整個(gè)過(guò)程均在冰上進(jìn)行。配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，立即放入PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)結(jié)束得到總cDNA后，立即進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-PCR)或-20 ℃保存。

1.5.3RT-PCR 嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)配制RT-PCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系為20 μl，操作過(guò)程均在冰上進(jìn)行。用熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。PCR條件：95 ℃、10 min，40個(gè)循環(huán)：95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，4 ℃ ∞。β-actin作為內(nèi)參， Capsase-3上游序列：5′-TTGAGACAGACAGTGGTGTTGATGATG-3′,下游序列：5′-ATAATAACCAGGTGCTGTGGAGTATGC-3′，樣品目的基因的相對(duì)表達(dá)率(relative quantitation，RQ)采用ΔΔCt方法計(jì)算，RQ=2-ΔΔCt(表示實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù))，ΔΔA Ct=-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)對(duì)照組。

1.6 Western blot檢測(cè)Caspase-3蛋白的水平收集不同濃度DDW處理72 h后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法定量蛋白，按抗體分子質(zhì)量要求配置分離膠和濃縮膠，每孔10 μl蛋白樣品上樣，電泳電壓80 V,電泳20 min后改為100 V，電泳2 h，轉(zhuǎn)膜電壓為100 V，電泳2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗膜10 min×3 次，孵Caspase-3一抗(1 ∶1 000)4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜10 min×3 次，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)室溫避光孵育2 h，ECL顯色拍照，以 β-actin 為內(nèi)參蛋白，目的蛋白相對(duì)含量用目的蛋白/內(nèi)參的灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1 DDW對(duì)肺癌細(xì)胞增殖活性的影響用不同濃度的DDW培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549，含50、 75、100 ppm DDW的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制率為10.59%、9.03%、3.97%；24 h的抑制率為13.62%、8.9%、7.8%；48 h的抑制率為15.74%、9.19%、9.31%；72 h的抑制率為19.42%、11.71%、7.05%。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.2 DDW對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡作用的影響不同濃度的DDW培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549后，晚期凋亡和總凋亡顯著增加。含50、75、100 ppm DDW的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h對(duì)肺癌細(xì)胞的總凋亡率分別為( 22.8±0.95)%、(16.9±0.49)%、(11.3±0.32)%，顯著高于對(duì)照組(1.1±0.2)%(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 不同濃度DDW對(duì)肺癌細(xì)胞A549增殖抑制的影響

與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DDW對(duì)肺癌細(xì)胞A549凋亡的影響

2.3 DDW對(duì)肺癌細(xì)胞中Caspase-3基因表達(dá)的影響用50、75、100 ppm DDW的培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌細(xì)胞(A549)72 h后 Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.256±0.067)、(1.114±0.037)、(1.058±0.022)。與正常培養(yǎng)基相比，Caspase-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.4 DDW對(duì)肺癌細(xì)胞中Caspase-3蛋白表達(dá)的影響用50、75、100 ppm DDW的培養(yǎng)基培養(yǎng)肺癌細(xì)胞(A549)72 h后，Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DDW能夠明顯上調(diào)A549細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖2 DDW對(duì)Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

A:50 ppm；B:75 ppm；C:100 ppm；D:對(duì)照組；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 Western blot法檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)水平

A:50 ppm； B:75 ppm； C:100 ppm； D:對(duì)照組；與對(duì)照組比較：**P<0.01

3 討論

凋亡是細(xì)胞生命體自行結(jié)束的方式，凋亡細(xì)胞最后可被吞噬細(xì)胞或鄰近細(xì)胞吞噬，不會(huì)引起炎性反應(yīng)。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡對(duì)抗腫瘤有著重要的意義，細(xì)胞凋亡的發(fā)生是細(xì)胞色素C從線粒體釋放，繼而激活Caspase,最終導(dǎo)致凋亡[7]。其中Caspase-3被認(rèn)為是凋亡反應(yīng)的執(zhí)行者，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起一個(gè)中心作用，它能通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)位置使細(xì)胞凋亡。在分子水平上Caspase-3的表達(dá)和活性的增加將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8-10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DDW主要影響早期凋亡、RT-PCR和Western blot驗(yàn)證Caspase-3在DDW處理后的肺癌細(xì)胞有強(qiáng)的表達(dá)，對(duì)照組細(xì)胞呈弱或陰性的表達(dá)。結(jié)果顯示DDW能顯著抑制肺癌的增殖，上調(diào)Caspase-3活性，其中50 ppm DDW作用較顯著，提示DDW促凋亡作用與激活Caspase依賴(lài)的凋亡途徑有關(guān)，揭示DDW輔助抗癌作用機(jī)制與凋亡蛋白Casapse-3有關(guān)。