郭 亮，肖 峻，陶 陶

前列腺癌(prostate cancer,PCA)是最常見的癌癥之一，也是全世界尤其是發(fā)達(dá)國家男性癌癥死亡的第二大原因。大多數(shù)患者最初對雄激素剝奪療法(ADT)敏感，然而逐漸對ADT無效，最終演變?yōu)槿菘剐郧傲邢侔?CRPC)[1]。CRPC難以治療，且容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移等，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移預(yù)后極差[2]。因此，深入了解PCA轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制將有助于提高PCA的治療。微小RNA (microRNA, miRNA) 是一類進(jìn)化上保守的非編碼小分子RNA，具有在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)的功能,通過調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)參與多種細(xì)胞活動，包括腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[3]。已有多項(xiàng)報(bào)道顯示miR-9-5p與肺癌[4]、乳腺癌[5]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[6]、骨肉瘤[7]等腫瘤均存在相關(guān)性，在肺癌中具有促癌的作用，而在口腔鱗狀細(xì)胞癌中具有抑癌作用。該研究通過real-time PCR分析了前列腺上皮細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)水平，并在前列腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-9-5p，觀察miR-9-5p對前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人永生化前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1、前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；FBS、RPMI1640培養(yǎng)基、KSF培養(yǎng)基、胰酶、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和牛腦垂體提取物(bovine pituitary extract,BPE)均購自美國Gibco公司；攜帶has-miR-9-5p的慢病毒(miR-9-5p)和陰性對照慢病毒(miR-NC)購自上海漢恒生物科技有限公司；Polybrene和Puromycin購自美國Sigma公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；MMLV Reverse Transcriptase試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；GenePharma Hairpin-it TM microRNA RT-PCR Quantitation Kit和miR-9-5p mimic購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；Transwell小室(8 μm)和Matrigel基質(zhì)膠購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；DualLuciferase Reporter Assay System購自美國Promega公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；Real-time PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)購自美國Thermo公司；酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) RWPE-1用含EGF、BPE、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的KSF培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。PC3和DU145使用含10%FBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2穩(wěn)定表達(dá)miR-9-5p細(xì)胞株的建立 向24孔板每孔接種5×104個(gè)PC3細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。次日棄去培養(yǎng)基，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋病毒并加入終濃度為10 mg/L的Polybrene，每孔加入2 ml稀釋病毒液使得感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為20，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換成新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，改用含Puromycin的培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)2周，篩選出穩(wěn)定表達(dá)miR-9-5p的PC3細(xì)胞(PC3/miR-9-5p)，同時(shí)制備穩(wěn)定感染陰性對照慢病毒的PC3細(xì)胞(PC3/miR-NC)，在熒光顯微鏡下觀察確定細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，通過熒光定量PCR檢測細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)水平。

1.2.3RNA提取和熒光定量PCR 細(xì)胞總RNA提取按照TRIzol說明書進(jìn)行，用Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)檢測A260和A280，計(jì)算純度和含量；使用MMLV Reverse Transcriptase試劑盒(大連寶生物公司)將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。再采用GenePharma Hairpin-it TM microRNA RT-PCR Quantitation Kit檢測miR-9-5p。PCR反應(yīng)在ABI StepOne Plus系統(tǒng)上進(jìn)行，反應(yīng)條件：95 ℃、10 min為預(yù)變性階段條件；95 ℃、12 s，62 ℃、40 s，共40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增階段條件；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s為溶解曲線階段條件。以U6作為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算miR-9-5p的相對表達(dá)量。對于CXCR4 mRNA的定量檢測同樣在ABI StepOne Plus系統(tǒng)上進(jìn)行，反應(yīng)條件為50 ℃、2 min，95 ℃、10 min為預(yù)變性階段條件；95 ℃、20 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。擴(kuò)增使用的引物為CXCR4 (accession number: NM_000201)F：5′-ATGCCCAGACATCTGTGTCC-3′，R：5′-GGGGTCTCTATGCCCAACAA-3′; U6 snRNA(accession number: NR_004394) F:5′-GCTTCGGCAGCACATA-3′，R：5′-ATGGAACGCTTCACGA-3′; GAPDH F：5′-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3′，R：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.4細(xì)胞增殖能力檢測 細(xì)胞增殖能力檢測使用CCK-8試劑盒進(jìn)行分析。將處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞用胰酶消化后按照2 000個(gè)細(xì)胞/孔接種96孔板，孵育過夜，每孔加入10 μl CCK-8溶液，于接種細(xì)胞后0、24、48、72、96 h通過酶標(biāo)儀檢測A450值，評價(jià)細(xì)胞增殖能力。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞增殖能力與A450值呈正相關(guān)性。

1.2.5細(xì)胞遷移和侵襲力檢測 細(xì)胞用胰酶消化后用不含血清的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至3×105個(gè)/ml，每孔接種0.1 ml至覆蓋或不覆蓋基質(zhì)膠的48孔Transwell膜上，在下方加入0.6 ml含10%FBS的培養(yǎng)基，對于遷移實(shí)驗(yàn)則繼續(xù)培養(yǎng)24 h；對于侵襲實(shí)驗(yàn)則繼續(xù)培養(yǎng)24 h；隨后將細(xì)胞固定，用0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)不同組穿膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.2.6生物信息學(xué)分析 通過TargetScan7.1(http://www.targetscan.org/)、PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/)、miRanda (http://www.microrna.org/)三種軟件分析miR-9-5p與CXCR43’-UTR的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.7雙螢光素酶報(bào)告基因分析 從通用生物技術(shù)有限公司購買包含野生型CXCR43’-UTR及預(yù)測與miR-9-5p結(jié)合位點(diǎn)突變的CXCR43’-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-CXCR4和mut-pGL3-CXCR4。將293T細(xì)胞接種至24孔板，過夜培養(yǎng)后將熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒、內(nèi)參質(zhì)粒(Renilla luciferase)和miR-9-5p mimic或?qū)φ胀瑫r(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后根據(jù)DualLuciferase Reporter Assay System的說明書操作裂解細(xì)胞，加入發(fā)光液后在酶標(biāo)儀上檢測。利用海腎素?zé)晒庾鳛閮?nèi)參照對結(jié)果進(jìn)行均一化處理。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR檢測miR-9-5p在RWPE-1、PC3和DU145細(xì)胞中的表達(dá)熒光定量PCR檢測顯示miR-9-5p在RWPE-1細(xì)胞中表達(dá)水平最高為(116.3±4.99)，DU145次之，為(42.30±2.66)，PC3最低為(23.47±2.43)。PC3細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)量顯著低于RWPE-1(t=16.72,P=0.000 1)和DU145(t=5.22,P=0.016)，因此選擇PC3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。見圖1。

圖1 熒光定量PCR檢測miR-9-5p在RWPE-1、PC3和DU145細(xì)胞中的表達(dá)

A：miR-9-5p在不同細(xì)胞中的表達(dá)水平；B：PCR擴(kuò)增的溶解曲線；與PC3比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 熒光定量PCR檢測miR-9-5p在PC3細(xì)胞中過表達(dá)熒光定量PCR檢測顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-9-5p的PC3/miR-9-5p細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)量為(165.20±5.78)，而在PC3/miR-NC細(xì)胞中表達(dá)量為(25.47±5.78)(t=22.42,P<0.000 1)，在PC3細(xì)胞中表達(dá)量為(25.56±3.01)(t=21.43,P<0.0001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

2.3 miR-9-5p抑制PC3細(xì)胞增殖CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖情況顯示，與細(xì)胞對照及慢病毒對照組相比，miR-9-5p能顯著抑制PC3細(xì)胞的增殖。見圖3。

2.4 miR-9-5p抑制PC3細(xì)胞的遷移和侵襲Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PC3、PC3/miR-NC和PC3/miR-9-5p組遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)分別是(1 194.05±82.33)、(1 189.33±95.97)、(461.30±49.97)，與PC3和PC3/miR-NC組相比，PC3/miR-9-5p細(xì)胞遷移數(shù)目顯著減少(F=265.31，P<0.0001)。PC3、PC3/miR-NC和PC3/miR-9-5p組侵襲細(xì)胞計(jì)數(shù)分別是(786.30±42.45)、(816.31±17.34)、(197.14±45.02)，與PC3和PC3/miR-NC組相比，PC3/miR-9-5p細(xì)胞遷移數(shù)目顯著減少(F=281.24，P<0.000 1)。見圖4。

圖2 熒光定量PCR鑒定miR-9-5p在PC3細(xì)胞中過表達(dá)

A：miR-9-5p在不同細(xì)胞中的表達(dá)水平；B：PCR擴(kuò)增的溶解曲線；1：PC3/miR-9-5p細(xì)胞；2：PC3/miR-NC細(xì)胞；3：PC3細(xì)胞；與PC3/miR-9-5p細(xì)胞比較：**P<0.01

圖3 miR-9-5p能夠抑制PC3細(xì)胞增殖

2.5 miR-9-5p能夠靶向作用于CXCR4 3’-UTR抑制CXCR4的表達(dá)通過生物信息學(xué)預(yù)測顯示miR-9-5p能夠靶向結(jié)合CXCR4的3’-UTR(圖5A)；雙熒光素酶報(bào)告基因分析顯示，miR-9-5p能夠靶向作用于CXCR4的3’-UTR抑制螢光素酶表達(dá)，當(dāng)對CXCR4的3’-UTR域進(jìn)行點(diǎn)突變處理后，miR-9-5p的抑制作用消失(圖5B、5C)。熒光定量PCR檢測的結(jié)果顯示，在過表達(dá)miR-9-5p的PC3/miR-9-5p細(xì)胞中，CXCR4的表達(dá)水平顯著低于PC3細(xì)胞(t=8.14,P=0.001 2)和PC3/miR-NC細(xì)胞(t=11.38,P=0.000 3)(圖5D)。

圖4 miR-9-5p抑制PC3細(xì)胞的遷移和侵襲

A：細(xì)胞遷移(24 h)；B：細(xì)胞侵襲(48 h)；1：PC3; 2:PC3/miR-NC；3：PC3/miR-9-5p;C：細(xì)胞遷移計(jì)數(shù)比較；D：細(xì)胞侵襲計(jì)數(shù)比較；a：PC3/miR-9-5p細(xì)胞；b：PC3/miR-NC細(xì)胞；c：PC3細(xì)胞；與PC3/miR-9-5p細(xì)胞比較：**P<0.01

圖5 miR-9-5p靶向作用于CXCR4 3’-UTR抑制CXCR4的表達(dá)

A：生物信息學(xué)預(yù)測miR-9-5p靶向結(jié)合CXCR4的3’-UTR；B：雙熒光素酶報(bào)告基因分析示意圖；C：雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果；D：熒光定量PCR檢測CXCR4 mRNA的表達(dá)水平；1：PC3細(xì)胞；2：PC3/miR-NC細(xì)胞；3：PC3/miR-9-5p細(xì)胞；與PC3細(xì)胞比較：**P<0.01；與PC3/miR-NC細(xì)胞比較：##P<0.01

3 討論

越來越多的證據(jù)表明異常表達(dá)的miRNA通過干擾miRNA /蛋白質(zhì)編碼基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[8]。鑒定異常表達(dá)的miRNAs是闡明miRNA引起腫瘤的第一步。一些臨床研究已經(jīng)表明在PCA存在大量異常表達(dá)的miRNAs，其中一部分作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮重要作用[9]。越來越多的研究顯示在多種腫瘤中miR-9-5p起著抑癌基因的作用，例如在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者外周血中miR-9-5p的表達(dá)水平顯著下降[6]；在骨肉瘤中由于miR-9-5p表達(dá)水平下降，導(dǎo)致其靶基因POU2F1的表達(dá)水平上升，從而促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)展[7]。此外，在肝臟星狀細(xì)胞中miR-9-5p能夠靶向作用于TGFBR1和TGFBR2抑制肝臟纖維化的進(jìn)展[10]。在TGF-β誘導(dǎo)的人真皮成纖維細(xì)胞纖維化過程中miR-9-5p能夠靶向作用于TGFBR2，抑制其表達(dá)，從而抑制纖維化的進(jìn)展[11]。

趨化因子(CXCL)及其受體(CXCR)在多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用，近期的研究[12]顯示其也參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。CXCRs在多種腫瘤類型中均高表達(dá)，包括乳腺癌、PCA、胰腺癌、肺癌和卵巢癌等[13]。CXCR4已被證實(shí)在癌癥的發(fā)展中具有重要作用，并可作為各種癌癥的預(yù)后標(biāo)志物[14]。一些研究顯示CXCR4在PCA中高表達(dá)，并與預(yù)后差密切相關(guān)，且參與PCA細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[15]。

本研究比較了正常PCA細(xì)胞RWPE-1以及PCA細(xì)胞株P(guān)C3和DU145，發(fā)現(xiàn)RWPE-1中miR-9-5p的表達(dá)水平顯著高于PC3和DU145。通過慢病毒構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)miR-9-5p的PC3細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-9-5p的PC3細(xì)胞(PC3/miR-9-5p)的增殖能力較慢病毒PC3/miR-9-5p和正常PC3顯著降低。Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)miR-9-5p也可以顯著降低PC3細(xì)胞的遷移和侵襲能力。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-9-5p能夠靶向作用于CXCR4的3’-UTR，雙熒光素酶報(bào)告基因的結(jié)果證實(shí)預(yù)測結(jié)果是正確的。在過表達(dá)miR-9-5p中CXCR4的mRNA水平顯著下降了。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-9-5p在PCA中可能通過靶向作用于CXCR4的3’-UTR，下調(diào)CXCR4表達(dá)，抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲。

總之，本研究結(jié)果顯示miR-9-5p可能通過下調(diào)CXCR4表達(dá)抑制PCA的增殖、遷移和侵襲。分析miR-9-5p調(diào)控PCA細(xì)胞生物學(xué)功能對PCA的診斷、治療及預(yù)后評價(jià)有重要意義。