陳秋生，林春燕，何 康，李明勇

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是起源于鼻咽黏膜被覆上皮的頭頸部腫瘤，其病因非常復雜，發(fā)病部位隱蔽，早期無明顯癥狀，大多數(shù)患者確診時已為中晚期；治療上，主要采用放療或放化療結合的方法進行，但由于轉移和原病灶復發(fā)等因素，NPC患者生存率和治愈率很低[1-2]。因此，從天然藥物中尋找高效、低毒的抗癌活性成分，單獨使用或與放療聯(lián)合使用，對提高NPC的生存率和治愈率具有重要意義。

槲皮素是廣泛存在于蔬菜、水果及藥用植物中的一種多羥基黃酮類化合物。近年來發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有抗腫瘤活性，它可以通過抑制細胞生長、侵襲及誘導細胞凋亡等方式發(fā)揮著抗腫瘤作用[3-5]。研究[6-7]表明，槲皮素在NPC中也能誘導細胞凋亡，但主要機制仍不明確。該研究以NPC細胞系CNE2為研究對象，對細胞凋亡進行了深入分析，發(fā)現(xiàn)了槲皮素誘導NPC細胞發(fā)生了非半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases，Caspase)依賴性凋亡，為臨床上NPC的治療提供了新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料CNE2細胞由本實驗室保存，槲皮素(Q4951)購自Sigma上海分公司；1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；溴化丙啶(propidium iodide，PI)、 Caspase抑制劑Z-vad-fmk、鼠抗人細胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)抗體和兔抗人凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor, AIF)抗體購自上海碧云天生物有限公司；Annexin V-FITC流式抗體購自美國Invitrogen公司；鼠抗人β-actin抗體、兔抗人DNA修復酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)抗體、兔抗人B 淋巴細胞瘤/白血病-2蛋白(B-cell lymphoma-2 protein，Bcl-2)抗體、兔抗人Bcl-XL抗體、兔抗人Mcl1抗體、兔抗人Bcl-2相關X 蛋白(Bcl2-associated X protein, Bax)抗體、鼠抗人Caspase-9抗體購自美國CST公司；鼠抗人XIAP抗體、鼠抗人Caspase-8抗體購自美國BD公司；鼠抗人Caspase-3抗體購自美國Novus公司，羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) CNE2采用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(含100 μg/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素)置于含5% CO2的37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8法檢測細胞活力 取對數(shù)期生長細胞2×103個/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后加入含不同濃度槲皮素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別培養(yǎng)24、48、72 h，在培養(yǎng)時間結束前2～4 h，每孔加入10 μl CCK-8檢測液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。結束后用酶標儀讀取在450 nm處的光密度值(optical density，OD)。計算所有樣品孔與對照孔的OD百分比，并求出槲皮素對CNE2細胞的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數(shù)期生長細胞1×105/ml傳代于六孔板中，待細胞貼壁后分別加入槲皮素100 μmol /L, 槲皮素100 μmol /L+Z-vad-fmk 20 μmol/L，Z-vad-fmk 20 μmol/L，另設空白對照組。各組細胞放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，結束后收集細胞并混懸于500 μl 結合緩沖液中；先后加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl 的PI，輕輕混勻，避光，室溫反應15 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 將各處理組細胞培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌3次，甩干液體后，冰浴條件下用RIPA裂解液裂解30 min，然后用低溫高速離心機13 000 r/min離心15 min。取上清液，采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量,蛋白樣品和上樣緩沖液按3 ∶1的比例混合, 100 ℃水中煮沸5 min使蛋白質變性。Western blot實驗方法參考《分子克隆實驗指南》[8]進行，以β-actin作內(nèi)參，電泳條帶用Glyko BandScan 圖像分析軟件進行光密度值分析。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計處理，兩兩比較采用t檢驗分析，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCK-8實驗結果不同濃度的槲皮素(0, 0.82、2.47、7.41、22.22、66.67、200.00 μmol/L)處理NPC細胞24、48、72 h后，均呈濃度依賴性和時間依賴性地抑制CNE2細胞增殖(F=37.423，P<0.05)，見圖1。采用LOGIT法回歸計算不同濃度槲皮素作用CNE2細胞24、48、72 h的IC50分別為89.6、64.9、46.4 μmol/L。

圖1 不同濃度槲皮素處理24、48 和72 h后CNE2的細胞活力

與空白對照組(0 μmol /L槲皮素)相同時間比較：#P<0.05；與相同濃度的24 h 存活率比較：*P<0.05

2.2 槲皮素誘導細胞凋亡情況流式細胞儀檢測結果顯示，槲皮素可明顯誘導CNE2細胞凋亡，且以早期凋亡為主。在槲皮素+Caspase抑制劑組中觀察到，抑制Caspase經(jīng)典途徑后，細胞凋亡比例仍較高(F=122.366，P<0.01)， 提示可能存在非Caspase依賴性細胞凋亡程序。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測槲皮素誘導CNE2細胞凋亡情況

A：對照組；B：槲皮素處理組；C：槲皮素+Caspase抑制劑組；D：Caspase抑制劑組

2.3 槲皮素對凋亡標志蛋白的影響采用Western blot檢測槲皮素對凋亡標志分子PARP和Caspase-3的影響。結果顯示，槲皮素處理組、槲皮素加Caspase抑制劑組能明顯檢測PARP被切割現(xiàn)象，而對照組、Caspase抑制劑組沒有檢測到，提示槲皮素能明顯切割細胞核內(nèi)PARP，從而使其失去酶活性，促進細胞凋亡。但槲皮素對Caspase-3蛋白水平的影響不顯著(P>0.05)。見圖3。

2.4 槲皮素對凋亡相關蛋白水平的影響為探索槲皮素誘導NPC細胞凋亡的分子機制，通過Western blot法檢測槲皮素對CNE2細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的影響。結果顯示，槲皮素能下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平(P<0.05)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(P<0.05)。見圖4。實驗進一步檢測槲皮素對線粒體釋放Cyt-C和AIF的影響。槲皮素處理組及槲皮素+Caspase抑制劑組中，CNE2細胞胞質中Cyt-c和AIF含量顯著增高，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖3 Western blot檢測槲皮素對凋亡標志蛋白的影響

A：對照組;B：槲皮素處理組;C：槲皮素+Caspase抑制劑組;D：Caspase抑制劑組

圖4 Western blot檢測槲皮素對凋亡相關蛋白的影響

A：對照組;B：槲皮素處理組;C：槲皮素+Caspase抑制劑組;D：Caspase抑制劑組；與對照組同種蛋白比較：*P<0.05

3 討論

眾所周知，槲皮素是中藥里抗癌能力最有效的成分之一，在不同腫瘤細胞中都表現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。在NPC細胞中也發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠抑制NPC細胞增殖，誘導細胞凋亡，但是其抗腫瘤機制，特別是槲皮素誘導NPC細胞凋亡的分子機制，仍未完全闡明。本研究以NPC細胞系CNE2為研究對象，通過CCK-8實驗、流式細胞術以及Western blot等技術，發(fā)現(xiàn)槲皮素誘導CNE2細胞發(fā)生了非Caspase依賴性凋亡。

圖5 Western blot檢測細胞溶質中AIF和Cyt C的含量

A：對照組;B：槲皮素處理組;C：槲皮素+Caspase抑制劑組;D：Caspase抑制劑組；與對照組同種蛋白比較：*P<0.05

經(jīng)典的細胞凋亡途徑主要包括外源性凋亡和內(nèi)源性凋亡，兩條途徑最終都是通過激活Caspases誘導凋亡，其中 Caspase-3 是凋亡過程中重要的終末剪切酶[9]。本實驗數(shù)據(jù)顯示，槲皮素誘導CNE2細胞凋亡過程中，Caspase-3沒有被檢測到切割激活。但作為凋亡標志蛋白的PARP能被檢測到切割帶。PARP是細胞核中與DNA修復密切相關的一種酶，對維持基因組穩(wěn)定性和細胞生存至關重要。當槲皮素誘導PARP被切割而失去酶活性后，細胞就會發(fā)生凋亡。這些證據(jù)說明，槲皮素誘導細胞凋亡，主要不是通過經(jīng)典的凋亡途徑。

為了進一步探索槲皮素誘導鼻咽癌CNE2細胞凋亡的具體機制，本實驗檢測了細胞促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2、AIF和Cyt-c的含量。AIF是一種定位于線粒體的黃素蛋白，它能促進線粒體釋放Cyt-c激活Caspase-9誘導內(nèi)源性凋亡，也能介導細胞發(fā)生非Caspase依賴性凋亡[10-11]。當細胞受到凋亡的刺激時，通過激活線粒體膜上 Bcl-2 家族的促凋亡Bax的表達和抑制Bcl-2的表達，引起線粒體外膜通透性改變并形成穩(wěn)定的孔隙，釋放AIF、Cyt-c等因子進入胞質。特別是AIF從線粒體釋放到細胞溶質后，進而轉位入核，引起染色質凝集和DNA大規(guī)模片段化(約50 kb)，進而引發(fā)不依賴 Caspase的凋亡途徑[12-13]。但是AIF引起染色質凝集和DNA片段化的機制目前還不是很清楚。實驗結果顯示，槲皮素處理NPC細胞24 h后，能下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達；在細胞溶質中明顯檢測到AIF、cyt-C 表達上調(diào)，有力地證明了槲皮素誘導CNE2細胞發(fā)生凋亡的主要機制是非Caspase依賴性凋亡途徑。