姚 順，詹 磊，孫士瑩，王文艷，衛(wèi) 兵

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer, EC)作為最常見的女性生殖系統(tǒng)癌癥之一，是第六大腫瘤死亡原因，而且EC在年輕女性中的發(fā)病率正在上升，流行病學調(diào)查顯示每年全世界有超過280 000個女性被診斷為EC患者[1]。目前臨床上EC的治療主要包括外科手術、放化療以及藥物治療，但這些治療方式療效均不是很好[2]。NLR家族含CARD結構域5[NOD like receptor (NLR) family, caspase recruitment(CARD) domaincontaining 5,NLRC5]，又稱MHC I反式激活因子，是2010年新發(fā)現(xiàn)的NLRs樣受體家族中的受體之一[3]。最新研究[4]發(fā)現(xiàn)，NLRC5在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，且NLRC5的水平與腫瘤患者發(fā)病率與存活率相關。但NLRC5對EC的作用及其機制尚不清楚。近年來，國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)，自噬可以參與NLRs的調(diào)節(jié)過程[5-6]。自噬是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種程序性細胞死亡形式，是溶酶體介導的細胞內(nèi)大分子物質(zhì)及細胞器降解的過程[7]。其過程需要依賴自噬相關蛋白LC3、Beclin1等的參與[8]。大量研究[9]證實自噬與腫瘤之間存在密切的聯(lián)系而且自噬在腫瘤的治療中具有潛在作用。但自噬是否參與NLRC5的調(diào)節(jié)過程目前尚無文獻報道。該研究探討NLRC5是否通過調(diào)控自噬在EC細胞中發(fā)揮作用，以期為該病的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 人子宮內(nèi)膜腺癌AN3CA細胞株(上海Sigma公司)由安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院實驗室保存，將細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、含1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中(美國Gibico公司)，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d換液1次。

1.1.2標本收集 收集EC患者手術切除的EC組織標本及門診病理顯示正常的子宮內(nèi)膜標本各20例，術前均未接受性激素的治療或輔助放化療。EC標本20例為實驗組，選取病例年齡為45～65(52±5.42)歲，平均年齡52歲。病理類型均為腺癌，手術病理分期為Ⅰ期。正常子宮內(nèi)膜標本20例作為對照組，且與研究組年齡差異無統(tǒng)計學意義，術前均未接受性激素的治療。標本在獲取知情同意后取自安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科臨床診斷明確的患者。符合倫理學要求(倫理編號：LLSC20180085)。

1.1.3主要試劑 NLRC5 (ab105411)兔多克隆抗體、Beclin1兔單克隆抗體、LC3B[EPR18709]兔單克隆抗體(美國Abcam公司)；ECL發(fā)光試劑盒、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗(美國affinity公司)；PVDF 膜(上海Biosharp公司)；綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)抗體(南京金斯瑞生物科技)；CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司)；GADPH、NLRC5、Beclin1、LC3引物序列(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)；NLRC5質(zhì)粒(武漢賽維爾生物科技有限公司構建)；免疫組化試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)；高糖DMEM液體培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)；PBS(美國Hyclone 公司)；jetPRIME?試劑(法國Polyplus-transfection公司)；胰蛋白酶、50×TAE 緩沖液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、Tris-HCl pH 8.8、Tris-HCl pH 6.8、青霉素、鏈霉素(上海碧云天公司)。

1.1.4主要儀器 Heraeus CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；FlexCycler多功能PCR儀(德國Jena公司)；生物安全柜、電泳儀(上海天能科技有限公司)；TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；酶標儀(上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 收集正常子宮內(nèi)膜組織及EC組織，組織石蠟切片脫蠟后，經(jīng)微波爐修復表面抗原、3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶、山羊血清封閉，加一抗：NLRC5抗體、Beclin1抗體、LC3抗體，4 ℃過夜，復溫后滴加與一抗相應種屬的二抗(HRP標記)，室溫孵育50 min，滴加鏈親和素—過氧化物酶溶液，室溫孵育10 min，滴加新鮮配制的DAB混合染液，室溫避光染色10 min，顯微鏡下觀察顏色。每組標本隨機選取若干個目的區(qū)域，通過Image-Pro-Plus 6.0分析系統(tǒng)分別計算各組樣本中NLRC5、Beclin1、LC3著色陽性面積百分比(%)，取均值進行比較。

1.2.2Western blot法檢測蛋白表達 RIPA裂解液提取組織及細胞總蛋白，BCA法定量后，按10 μl/孔的量加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結束后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。孵一抗：各蛋白抗體分別參考抗體說明書進行操作，4 ℃ 孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。孵二抗：相應二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光、顯影，以β-actin為內(nèi)參，分析各指標的相對表達量。

1.2.3qRT-PCR法檢測mRNA水平 收集轉(zhuǎn)染后的細胞，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，測RNA的OD260 mm/OD280 mm比值及濃度，再以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green試劑盒進行qRT-PCR,每組樣本應重復檢測3次。GADPH引物序列上游引物：5′-GGTTGAGCAGGTACTTT-3′;下游引物:5′-AGCAAGAGCACAAGAGGAAG-3′。NLRC5引物序列上游引物：5′-CTATCAACTGCCCTTCCACAAT-3′;下游引物:5′-TCTCTATCTGCCCACAGCCTAC-3′。Beclin1引物序列上游引物:5′-AGCACCATGCAGGTGAGCTT-3′;下游引物:5′-TGACACGGTCCAGGATCTTG-3′。LC3引物序列上游引物:5′-AGCAGCATCCAACCAAAATC-3′;下游引物:5′-CTGTGTCCGTTCACCAACAG-3′。以上引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.4CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況 將轉(zhuǎn)染24、48、72 h后的細胞接種在96孔板中(100 μl/孔)，每孔2×103個細胞，每組3個復孔，待細胞貼壁后每孔中加10 μl的CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，用酶標儀測定450 mm處吸光度值測定各組細胞的增殖情況，實驗重復3次，以實驗測得的均值為實驗結果。

1.2.5質(zhì)粒構建 NLRC5質(zhì)粒(其序列如下：上游引物:5 -CCGGAATTCCGGATGGCCAGGAAGCTGGA-3，下游引物:5-GGGATCCCGTCACCTGAGTGTCTTCCCA-3)由武漢賽維爾生物科技有限公司構建，經(jīng)鑒定證實構建成功。

1.2.6細胞轉(zhuǎn)染 當細胞長滿時接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)細胞至匯合度為70%時，使用jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑并參考其說明書進行細胞轉(zhuǎn)染。將2 μg NLRC5質(zhì)粒稀釋至200 μl緩沖液中，通過上下吸管混合。加入4 μl jetPRIME?轉(zhuǎn)染試劑，渦旋10 s，低速離心數(shù)秒，在室溫孵育10～15 min。取出6孔板，每孔中加入2 ml含10%胎牛血清和1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物添加至含10%胎牛血清和1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基的細胞中。轉(zhuǎn)染后24 h用含10%胎牛血清和1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，用于后續(xù)檢測。

2 結果

2.1 子宮內(nèi)膜組織與EC組織中NLRC5及自噬因子表達收集EC組織標本和正常子宮內(nèi)膜標本各20例，免疫組化結果顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，NLRC5蛋白在EC組織中表達相對較低，而自噬相關蛋白Beclin1、LC3在EC組織中表達相對較高，見圖1。同時Western blot結果分析顯示EC組織與正常子宮內(nèi)膜相比， NLRC5蛋白表達相對較低，而自噬相關蛋白Beclin1、LC3相對較高，見圖2，各指標組間差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

圖1 正常子宮內(nèi)膜組與EC組NLRC5、Beclin1、LC3免疫組化 ×200

表1 正常子宮內(nèi)膜組與EC組NLRC5、Beclin1、LC3蛋白表達水平

2.2 NLRC5對AN3CA細胞自噬的作用轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒后通過qRT-PCR和Western blot檢測，轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比，自噬蛋白Beclin1、LC3的蛋白表達水平降低(圖3、4)；各指標組間差異有統(tǒng)計學意義(表2、3)。

表2 未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組NLRC5、Beclin1、LC3蛋白表達水平

2.3 NLRC5對EC細胞(AN3CA)細胞增殖的影響轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染24、48、72 h后分別用CCK-8法檢測兩組細胞的增殖情況，結果顯示轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組細胞增殖明顯增加，見圖5。各指標組間差異有統(tǒng)計學意義，見表4。

圖2 Western blot法檢測組織蛋白表達情況

1、2、3：正常子宮內(nèi)膜標本；4、5、6：EC標本；與正常子宮內(nèi)膜組比較：*P<0.05

圖3 Western blot法檢測過表達NLRC5細胞蛋白表達情況

圖4 實時定量PCR檢測過表達NLRC5細胞中NLRC5、Beclin 1、LC3 mRNA水平

表3 未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA表達水平

圖5 CCK-8檢測細胞增殖情況

表4 CCK-8檢測未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染組AN3CA細胞活力

2.4 NLRC5促進AN3CA細胞增殖的機制本實驗分四組，兩組轉(zhuǎn)染組和兩組未轉(zhuǎn)染組，其中一組轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒24 h后加自噬激動劑雷帕霉素(50 nmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后分別用CCK-8法檢測4組細胞的增殖情況，結果顯示，轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組相比，細胞增殖明顯增加(P<0.05)；轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒后同時加雷帕霉素組與只轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組相比，細胞自噬水平升高，但細胞增殖明顯下降(P<0.05)，見圖6。轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組比較，0、24、48 h的F值分別為17.72、80.73、145.8，與轉(zhuǎn)染同時加雷帕霉素組比較，24 h、48 h的F值分別為13.06、17.62，各指標組間差異有統(tǒng)計學意義，見表5。

圖6 CCK-8檢測細胞增殖情況

與未轉(zhuǎn)染組比較：*P<0.05；與轉(zhuǎn)染同時加雷帕霉素組比較：#P<0.05

表5 CCK-8檢測各組AN3CA細胞活力

與未轉(zhuǎn)染組比較：*P<0.05；與轉(zhuǎn)染+雷帕霉素組比較：#P<0.05

3 討論

EC是女性生殖系統(tǒng)中常見的三大惡性腫瘤之一，位居女性常見癌癥的第六位。據(jù)統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)每年有超過20萬的EC新增病例，其發(fā)病率和死亡率逐年增高，并且呈年輕化趨勢，嚴重危害女性的身心健康[10]。但是，其影響機制尚不明確。

NLRC5是2010年新發(fā)現(xiàn)的NLRs樣受體家族中的受體之一[3]。NLRC5在多種腫瘤中表達相對偏低，而NLRC5在肝細胞癌、結直腸癌以及腦部腫瘤中相對偏高[11]。Peng et al[12]發(fā)現(xiàn)NLRC5可以促進肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。但是NLRC5是否可能參與EC的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。因此，本實驗主要研究NLRC5的表達變化，觀察其是否可能參與EC發(fā)生發(fā)展，并初步探討其可能的作用機制。為觀察NLRC5在EC中的表達，本實驗通過收集EC組織和正常子宮內(nèi)膜組織，免疫組化及Western blot結果顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，在EC中，NLRC5蛋白表達是下調(diào)的。為了證實NLRC5與EC間的關系，本研究CCK-8結果顯示轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組細胞增殖明顯增加。綜上所述，NLRC5可能促進EC細胞的增殖，但其如何影響EC細胞增殖，機制尚不明確。

近年來，國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)，自噬參與NLRs的調(diào)節(jié)過程[5-6]。自噬是一種保守的溶酶體降解途徑，在此過程中細胞內(nèi)物質(zhì)被降解和再循環(huán)[13]。自噬已被證實對腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著重要的作用，但結論仍存在爭議，最初認為自噬是腫瘤抑制機制，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌細胞中自噬抑制腫瘤發(fā)生[14]。但是，在肝癌早期階段，自噬可破壞腫瘤組織以達到抑制腫瘤增殖的作用，當癌細胞劇增達到腫瘤晚期階段時，自噬降解的受損細胞器又為腫瘤提供營養(yǎng)支持，使癌細胞不斷繁殖[15]。因此自噬在癌癥中的作用是復雜的，并且受背景條件的影響[13]。本實驗免疫組化及Western blot結果顯示EC組織與正常子宮內(nèi)膜組織比較，在EC組織中自噬蛋白Beclin1、LC3的蛋白表達水平上調(diào)。那么自噬是否參與NLRC5的調(diào)節(jié)，目前尚不清楚。為探究NLRC5是否可能通過調(diào)控自噬在EC中發(fā)揮作用，選擇AN3CAEC細胞株作為體外實驗的研究對象。通過qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染組相比，自噬蛋白Beclin1、LC3的蛋白表達水平下調(diào)。進一步研究該途徑如何影響EC的作用，本研究CCK-8檢測結果表明轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組與未轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組相比，細胞增殖明顯增加；轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒后同時加雷帕霉素組與只轉(zhuǎn)染NLRC5質(zhì)粒組相比，細胞自噬水平升高，但細胞增殖明顯下降。以上研究結果表明NLRC5可能通過抑制自噬進而促進EC細胞的增殖。

綜上所述，本研究結果表明在EC組織標本中NLRC5的蛋白表達水平下調(diào)，而自噬相關蛋白Beclin1、LC3的蛋白表達水平上調(diào)；過表達NLRC5后，EC細胞自噬水平下降，但EC細胞增殖升高；相反，過表達NLRC5后，提高自噬水平，細胞增殖反而下降。因此，NLRC5可能通過抑制自噬促進EC細胞增殖，NLRC5可能成為EC治療的新靶點。