石 慧,柳長柏,肖和杰

石慧,海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 海南省?？谑?570000

石慧,柳長柏,三峽大學腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室 湖北省宜昌市 443000

石慧,柳長柏,肖和杰,三峽大學肝病研究所 湖北省宜昌市 443000

0 引言

在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中由于慢性炎癥刺激肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)被活化,由靜止的儲脂細胞轉變成肌成纖維細胞(myofibroblast,MFB)并合成分泌大量纖維化相關因子和膠原蛋白[1].TGF-β1在肝纖維化病理發(fā)展過程中發(fā)揮著極其重要的作用,BMP-7是TGF-β超家族成員之一,許多研究表明BMP-7能夠拮抗TGF-β的促纖維化作用,在肝纖維化進展過程中,BMP-7表達水平被逐漸下調(diào)[2].

ALK3屬于BMPs的持續(xù)活化Ⅰ型受體,無需BMP-7與BMP-7Ⅱ受體結合,磷酸化細胞內(nèi)相關信號蛋白Smad1/5/8,磷酸化Smad1/5/8進而結合Smad4轉移至細胞核并誘導下游靶基因表達.本實驗利用BMP-7Ⅰ型受體的持續(xù)性活化突變基因真核表達載體pcDNA3-HASL-ALK3(QD)轉染大鼠HSCs株(HSC-T6),建立穩(wěn)定高表達持續(xù)活化型BMP-7Ⅰ型受體ALK3細胞株.無需BMP-7刺激,持續(xù)活化型ALK3即可激活下游信號通路,探討持續(xù)活化型ALK3對HSC-T6的影響,探討活化BMP-7信號通路抗肝纖維化分子機制.

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠HSCs、DH5α大腸桿菌為三峽大學肝病研究所保存;真核表達載體pcDNA3 -HASL-ALK3(QD)質粒由日本東京大學宮園浩平教授惠贈;限制性核酸內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、RevertAidTM M-MuLV逆轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司;DNA純化試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品;LipofectamineTM2000和Trizol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品;小鼠Samd1單克隆抗體、兔抗山羊P-Smad1多克隆抗體、山羊抗兔E-cadherin多克隆抗體、兔抗山羊col1A2多克隆抗體均為 Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品;小鼠α-SMA單克隆抗體為Sigma公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶標記兔抗山羊、山羊抗兔、羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司;ECL化學發(fā)光檢測試劑為GE Healthcare公司產(chǎn)品,MTT及培養(yǎng)基DMEM購自美國Sigma公司;寡聚核苷酸引物由上海生工技術服務有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及傳代：本實驗所用的細胞株大鼠HSCsHSC-T6置于含10%小牛血清及1%青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)液DMEM,37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細胞傳代方法：棄去舊的培養(yǎng)液,用3 mL PBS洗2次后,每瓶500 μL1%胰蛋白酶消化細胞1 min;用3 mL細胞完全培養(yǎng)液終止消化并將細胞懸液轉入15 mL離心管中,800 rpm離心3 min,棄上清液;細胞用培養(yǎng)液重懸后,以1：3的比例傳代.

1.2.2 重組質粒鑒定：用重組質粒pcDNA3-HASL-ALK3轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞,用含0.1 g/L氨芐青霉素的瓊脂糖培養(yǎng)平板進行篩選,挑取陽性單克隆菌落擴增培養(yǎng),提取質粒并用EcoRI/XhoI進行雙酶切鑒定.酶切鑒定正確的質粒純化后送上海生工生物工程有限公司測序.測序結果用DNAMAN與GenBank序列比對無誤.

1.2.3 建立穩(wěn)定高表達持續(xù)活化型ALK3受體的HSC-T6細胞株：大鼠HSC-T6在轉染前1 d傳代,長至細胞融合約80%,轉染前1 h換為無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)液孵育.應用LipofectamineTM2000試劑法用純化的重組質粒pcDNA3-HASL-ALK3轉染HSC-T6細胞,同時轉染空載質粒pcDNA3.1作為對照.37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱孵育4-6 h后更換為DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后換為濃度800 μg/mL Neomycin的完全培養(yǎng)液進行篩選,2-3 d更換一次培養(yǎng)液,待細胞克隆形成后,挑取單克隆細胞進行擴大培養(yǎng).

1.2.4 RT-PCR法篩選穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3的HSC-T6細胞株：分別收集穩(wěn)定轉染重組質粒pcDNA3-HASL-ALK3及空載質粒pcDNA3.1的HSC-T6細胞,提取細胞總RNA,經(jīng)DU730紫外分光光度儀檢測在260 nm處的吸光度值,A260nm/A280nm比值均介于1.8-2.0之間,RNA瓊脂糖凝膠電泳28 S、18 S和5 S條帶清晰可見,表明抽提的RNA較完整,未見明顯降解.提取的總RNA經(jīng)逆轉錄合成cDNA第一鏈,并以合成的cDNA為模板進行PCR反應.col1A2上游引物：5'-TGGTCTTACTGGGA ACTTTG-3',下游引物：5'-CCGTTTGTCCGGGCTCAC CA-3';col3A1上游引物：5'-GTTCTGTAATATGGAAAC CGGAG-3',下游引物：5'-CAAGGACATCTTCAGGAA GATC-3',col4A2上游引物：5'-CTGGACCCAAAGGAC AACC-3',下游引物：5'-ACGGGTCCAGGGTCTCCT-3';E-cadherin上游引物：5'-CTCGTGGCTTTGTCAGCA-3',下游引物：5'-GACCCAGTCTCGTTTCTG-3',α-SMA上游引物：5'-GTGTGAAGAGGAAGACAG-3'下游引物：5'-TTGGCCTTAGGGTTCAGC-3',以GAPDH為內(nèi)參照,上游引物：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3',下游引物：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3',PCR循環(huán)條件：94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環(huán)后,72 ℃ 5 min結束擴增.PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并在凝膠掃描儀下觀察記錄結果.獲得穩(wěn)定高表達持續(xù)活化型ALK3的細胞株命名為CA-ALK3-T6,穩(wěn)定轉染空載體質粒細胞株命名為Vector-T6.

1.2.5 Western blotting法檢測穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3對HSC-T6細胞的影響：收集并裂解細胞提取總蛋白,用BCA試劑盒蛋白定量后進行SDS-PAGE分離蛋白,采用濕轉法將蛋白質轉移至PVDF膜上,1%脫脂奶粉封閉過夜后,分別用小鼠Samd1單克隆抗體(1：800稀釋)、兔抗山羊P-Smad1多克隆抗體(1：800稀釋)、山羊抗兔E-cadherin多克隆抗體(1：1000稀釋)、兔抗山羊col1A2多克隆抗體(1：800稀釋);小鼠α-SMA單克隆抗體(1：1000稀釋)和小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(1：4000稀釋)孵育2 h,TBST洗膜10 min/次3次,再分別用辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(1：4000稀釋),兔抗山羊IgG(1：8000稀釋)和羊抗小鼠IgG(1：5000稀釋)孵育1 h,TBST洗膜3次(10 min/次),采用ECL增強化學發(fā)光法檢測結果.

1.2.6 MTT法檢測穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3對HSC-T6細胞株增殖的影響：以2×104個/ml的細胞密度,接種于96孔板中,100 μL/孔;待細胞完全貼壁后,加入MTT(200 μg/mL,無血清DMEM培養(yǎng)基配制),37 ℃繼續(xù)孵育4 h,去除培養(yǎng)基后每孔加入150 μL的DMSO,室溫搖床振蕩充分溶解結晶,全自動酶標儀570 nm波長測定各孔吸光度(OD)值,并以此檢測時間點為0 h.用同樣的方法測定細胞培養(yǎng)24、48、72 h各時間點的OD值,以各時間點的OD值與0 h OD值的比值反映細胞增殖的速度.

統(tǒng)計學處理應用SPSS 13.0進行分析,數(shù)據(jù)以mean±SD表示,樣本均數(shù)比較采用t檢驗,同一藥物不同濃度組間采用單因素方差分析進行比較,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3受體對HSC-T6細胞形態(tài)的影響 倒置相差顯微鏡下,對照組Vector-T6細胞呈單層生長,細胞間連接疏松,細胞偽足多呈星形,胞質薄而透明,核橢圓;而CA-ALK3-T6細胞連接緊密,細胞成多角形或蝌蚪形,胞質飽滿,核圓大(圖1).

2.2 穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3受體對HSC-T6細胞生長增殖的影響 為觀察穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3受體后對HSC-T6細胞生長增殖的影響,我們采用MTT法檢測了穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3對HSC-T6細胞增殖的影響(圖2).與0 h相比,當培養(yǎng)24 h CA-ALK3-T6細胞和Vector-T6細胞增殖倍數(shù)分別為1.5和2.6倍;當培養(yǎng)48 h,對Vector-T6細胞增殖倍數(shù)為4.3倍,而CA-ALK3-T6細胞為1.7倍(P＜0.05);隨著時間的延長,CA-ALK3-T6細胞增殖速度較對照細胞要慢(P＜0.05).因此穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3受體后可抑制HSC-T6細胞的活化增殖,并且具有時間依賴性.

2.3 半定量RT-PCR檢測穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3受體HSC-T6細胞α-SMA、col1A2等基因表達水平 分別收集CA-ALK3-T6細胞和Vector-T6細胞,提取總RNA,經(jīng)逆轉錄合成cDNA,并以其作為模板進行RT-PCR反應.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀下觀察記錄結果(圖3).電泳結果顯示,與陰性對照組Vector-T6細胞相比,CA-ALK3-T6細胞株α-SMA、col1A2、col3A1、col4A2 mRNA表達水平明顯下調(diào),而E-cadherin水平上調(diào).

2.4 Western blotting檢測穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3受體HSC-T6細胞BMP信號轉導相關蛋白 我們進一步檢測了穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3受體HSC-T6細胞BMP信號轉導及纖維化相關蛋白表達,培養(yǎng)CA-ALK3-T6細胞和Vector-T6細胞,分別收集細胞并提取細胞總蛋白,進行Western blotting分析.與陰性對照細胞株Vector-T6相比,CA-ALK3-T6細胞P-Smad1磷酸化水平明顯上升、E-cadherin表達水平上調(diào),α-SMA,col1A2蛋白表達下降,Smad1蛋白水平未見明顯改變.以β-actin作為內(nèi)參照,凝膠成像系統(tǒng)成像(圖4).

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段,是由各種致病因子引起肝臟損傷和炎癥,產(chǎn)生多種細胞因子刺激多種細胞發(fā)生上皮-間充質轉化(epithelial to mesenchymal transition,EMT),產(chǎn)生大量細胞外基質(extracellular matrix,ECM)并在肝臟沉積,近年來,EMT參與肝纖維化被日漸提出,但肝臟中EMT的發(fā)生機制尚不完全明確.肝纖維化過程中發(fā)生EMT的最主要細胞為HSCs,HSCs活化增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[3].Yu等[4]也提出HSCs的激活是肝纖維化的一個關鍵事件,被認為是EMT過程.EMT主要表現(xiàn)為細胞間粘附削弱,E-cadherin等上皮細胞分子標記表達下調(diào),間質細胞標志分子如a-SMA表達上調(diào),典型的細胞外基質成份如Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型膠原蛋白分泌增加[5].因此如何抑制上皮間質轉化是治療肝纖維化重要策略之一.

TGF-β參與HSCs發(fā)生EMT,直接或間接引起肝肌成纖維細胞的增加[6].BMP-7是一分子大小35KD的分泌性同源二聚體蛋白,屬于TGF-β超家族成員之一[7].BMP-7受體是一種跨膜絲/蘇氨酸激酶受體,BMP-7首先與Ⅱ型受體結合,Ⅱ型受體的蛋白激酶被激活,再與Ⅰ型受體結合,形成異源二聚體,催化Ⅰ型受體GS區(qū)的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化.Ⅰ型受體被激活后,作用于Smad1、Smad5或Smad8的C端SSXS模體,使其磷酸化,再與Smad4形成復合物,進入核內(nèi)與多種轉錄因子相互作用發(fā)揮基因調(diào)控作用[8].BMP-7基因表達不足也是纖維化進展的重要原因之一[9].Zeisberg等[7]在慢性腎纖維化小鼠模型中高表達BMP-7能有效拮抗TGF-β1誘導的上皮間質轉化.研究還顯示,BMP-7通過影響TGF-β1信號通路的下游蛋白—Smads蛋白來阻斷其信號轉導[10].

本文運用真核表達載體pcDNA3-HASL-ALK3(QD)建立穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3受體的大鼠HSCs株(CA-ALK3-T6).實驗結果顯示,持續(xù)活化型ALK3高表達可使大鼠HSCs形態(tài)趨向靜止化,抑制大鼠HSCs活化增殖,進一步觀察發(fā)現(xiàn),BMP7信號通路下游信號分子Smad1磷酸化增加、上皮細胞標志分子E-Cadherin表達水平上調(diào);同時,間質細胞標志物α-SMA以及Ⅰ型膠原mRNA及蛋白表達水平下降,Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白的mRNA水平下降.說明在大鼠HSCs中BMP-7信號通路的持續(xù)活化可逆轉HSCs活化,抑制TGF-β1誘導的上皮間質轉化和肌成纖維細胞增殖;減少ECM的分泌,從而改善肝纖維化.Yu等[4]研究發(fā)現(xiàn),在肝纖維化過程中,MEG3在體內(nèi)和體外均有降低,MEG3過表達導致肝纖維化的抑制,減少α-SMA和I型膠原蛋白.MEG3過表達通過EMT抑制HSC激活,與上皮標記物增加和間充質標記物減少有關.由此可見EMT是HSC激活致肝纖維化過程的關鍵環(huán)節(jié).王麗惠等[11]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激HSC-T6后細胞形態(tài)發(fā)生變化,偽足增多呈星形,細胞間連接呈疏松狀態(tài),呈現(xiàn)活化生物學特征.本實驗研究通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),BMP-7信號通路持續(xù)活化導致大鼠HSCs的形態(tài)學失去活化形態(tài)特征而趨向靜止化變化.

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài).

圖2 MTT法檢測穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3受體對HSC-T6細胞增殖的影響(mean±SD,n = 3).

圖3 RT-PCR檢測穩(wěn)定表達持續(xù)活化型ALK3受體HSC-T6細胞相關基因表達.

肝纖維化傳統(tǒng)上被認為是一個不可逆轉的過程,但以上本研究顯示了BMP-7信號轉導可抑制TGF-β1信號通路的致纖維化效應,為BMP-7成為治療肝纖維化的關鍵靶點奠定基礎.有望以激活BMP-7信號轉導為靶點來探索、開發(fā)抗肝纖維化藥物并應用到臨床.

圖4 Western blotting方法檢測相關蛋白水平表達.

文章亮點

實驗背景

二是在研判市情中增強緊迫感。市紀委、監(jiān)委嚴格對照上級要求檢視全市生態(tài)文明建設，深切感悟到保障污染防治攻堅戰(zhàn)工作的艱巨性和緊迫性。鹽城生態(tài)優(yōu)勢明顯，但生態(tài)環(huán)境保護形勢也比較嚴峻，特別是少數(shù)地方政績觀存在偏差，貫徹新發(fā)展理念不夠堅決，環(huán)保執(zhí)法不嚴，縱容環(huán)境違法行為，造成惡劣社會影響。今年上半年，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司嚴重環(huán)境污染事件被生態(tài)環(huán)境部通報，大豐、濱海、響水三個縣區(qū)被省生態(tài)環(huán)境廳區(qū)域限批，教訓十分深刻。

雖然隨著人們生活水平的提高及乙肝疫苗接種,我國乙型肝炎發(fā)病率逐年降低,但是酒精性及丙型肝炎引起的肝硬化卻并不少見,研究數(shù)據(jù)顯示,感染人員就診者不足1/3,簡直是冰山一角,長期不管理的結果便是肝硬化甚至迅速進展至肝癌,肝硬化是各種慢性肝病的晚期階段,治療效果差,且耗費大量資源,慢性乙型病毒性肝炎臨床治愈(珠峰)工程項目、國家“十二五”傳染病重大專項等課題對于肝硬化的研究及治療有巨大的貢獻,但目前仍未研究出并適用臨床的有效逆轉肝硬化方法.

實驗動機

擬通過探討肝硬化分子發(fā)生機制找到逆轉的肝硬化關鍵靶點.

實驗目標

本實驗觀察到通過研究BMP7及下游信號通路抑制肝纖維化與肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)能逆轉肝硬化核心細胞HSCs.

實驗方法

倒置相差顯微鏡、MTT、半定量PCR、western-blotting.

本文實驗研究達到我們預期的結果,印證了肝纖維化分子發(fā)生發(fā)展機制,我們觀察到持續(xù)活化的HSCs增殖受到抑制,并且向未活化方向逆轉,探索了其中的分子機制,磷酸化的smad1水平顯著升高,α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達下調(diào),而E-cadherin表達上調(diào).本研究提示BMP7有希望成為肝纖維化的分子治療靶點.

實驗結論

本研究采用持續(xù)活化型ALK3的新方法,進一步探索了肝纖維化分子發(fā)病機制,觀察到肝纖維化關鍵細胞HSCs活化有逆轉,進一步印證BMP7有望成為肝纖維化分子治療靶點,為將來肝纖維化的治療提供新的契機.

展望前景

本實驗采取成熟的實驗方法,提出了我們的觀點,但通過評審專家的意見確實有些忽略之處,會吸取經(jīng)驗教訓,使實驗更加嚴謹,本研究未來研究方向是動物模型的研究,未來研究方法的最佳方法仍主要以分子生物學研究方法為主.