張希成,沈金根,賈正我,錢(qián)麗芬,孫元龍

張希成,沈金根,賈正我,錢(qián)麗芬,孫元龍,浙江省桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省桐鄉(xiāng)市 314500

0 引言

胃癌是全球第四大常見(jiàn)癌癥,也是全球癌癥死亡的第三大原因.在中國(guó),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,就發(fā)病率(每10萬(wàn)人中有679.1人)和死亡率(每10萬(wàn)人中有498.0人)而言,胃癌是第二大常見(jiàn)癌癥[1].近年來(lái),隨著胃鏡檢查和手術(shù)技術(shù)的發(fā)展,早期胃癌的5年死亡率顯著降低,然而,對(duì)于晚期胃癌,5年死亡率仍為30%-50%[2].晚期胃癌死亡率與腹膜播散,血行播散和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān).因此,有必要探討胃癌進(jìn)展的機(jī)制,如增殖,生長(zhǎng),凋亡,遷移和侵襲.大量研究表明,微小RNA(microRNA,miRNA)在胃癌進(jìn)展中起重要作用[3-5].miRNA是高度保守的非編碼序列,其長(zhǎng)度通常為18至24個(gè)核苷酸,通過(guò)與靶基因mRNA的3'UTR結(jié)合,以抑制靶基因翻譯或誘導(dǎo)其降解.迄今為止,已經(jīng)鑒定了超過(guò)2500種miRNA(miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)),并且它們的異位表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng),侵襲,轉(zhuǎn)移,腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)[6].miR-183是一種在不同物種中高度保守的miRNA,最近的證據(jù)表明,其在乳腺癌、膀胱癌和子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中異常表達(dá),參與腫瘤的形成和進(jìn)展[7-9].已有報(bào)道表明miR-183在胃癌組織中表達(dá)水平降低,發(fā)揮抑癌基因的作用,但其作用機(jī)制目前尚不完全清楚[10].Wnt/β-catenin信號(hào)通路普遍存在于動(dòng)物體,在調(diào)控機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、腫瘤發(fā)生等多種生理病理中扮演重要角色[11,12].目前研究顯示,Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胃癌中高度激活,且與胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13].目前關(guān)于miR-183是否通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性的研究尚無(wú)報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)以胃癌SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象,探究miR-183影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移可能的機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 材料 人正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞及4株胃癌SGC-7901、NCI-N87、MKN-28和MKN-45細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù);胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;青霉素、鏈霉素購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;PRIM-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;miR-183 mimics及mimis Control購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitogen公司;MTT試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;AnnexinⅤ-FITC/PI細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自碧云天生物科技研究所;兔抗Bax一抗和兔抗Cleaved Caspase-3一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;兔抗β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和Cyclin D1抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：人正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞及胃癌SGC-7901、NCI-N87、MKN-28和MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的PRIM-1640培養(yǎng)基中,置于5%CO2、相對(duì)濕度95%、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),及時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并更換新鮮培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合率在80%以上時(shí),使用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞,進(jìn)行傳代培養(yǎng).

選擇SGC-7901細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對(duì)象,轉(zhuǎn)染前1 d,將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞種植到6孔板中,置37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng),采用Lipofectamine 2000分別將miR-183 mimics和對(duì)照mimics Control轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞,分別記為miR-183組和miR-NC組,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照,即未轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞記為Blank組.具體操作步驟參考Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書(shū),轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)液.

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)各細(xì)胞中miR-183的表達(dá)水平：分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GES-1、SGC-7901、NCI-N87、MKN-28、MKN-45及轉(zhuǎn)染48 h后各組SGC-7901細(xì)胞,使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以總RNA為模板合成cDNA,測(cè)定cDNA濃度,以cDNA為模板使用熒光定量PCR試劑盒擴(kuò)增目的產(chǎn)物,擴(kuò)增條件設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性20 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸10 s,共設(shè)40個(gè)循環(huán).以U6為內(nèi)參,使用2-△△Ct法計(jì)算各細(xì)胞系及各組SGC-7901細(xì)胞中miR-183相對(duì)表達(dá)水平.

1.2.3 MTT法檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞增殖能力：收集轉(zhuǎn)染48 h后各組SGC-7901細(xì)胞接種于96孔板中,每孔5×103個(gè),待細(xì)胞貼壁后按照方法1.2進(jìn)行轉(zhuǎn)染和分組,分別在轉(zhuǎn)染12、24、48、72 h時(shí),向每孔細(xì)胞中加入10 μL濃度為5 mg/mL的MTT,于37 ℃下孵育4 h,棄上清后每孔細(xì)胞中加入150 μL二甲基亞砜,避光反應(yīng)10 min,使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔細(xì)胞在490 nm處OD值,每組細(xì)胞每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：收集轉(zhuǎn)染48 h后各組SGC-7901細(xì)胞,用預(yù)冷PBS洗滌2次,收集約1×106個(gè)細(xì)胞,加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,再向細(xì)胞中分別加入5 μL FITC-AnnexinⅤ和5 μL PI染液,輕輕混勻,避光孵育30 min,立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力：使用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠,稀釋的Matrigel膠包被Transwell小室的上室面,風(fēng)干待用.分別收集轉(zhuǎn)染24 h各組SGC-7901細(xì)胞,以無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,制成2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,取200 μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室(Transwell遷移實(shí)驗(yàn)上室不以Matrigel膠包被),在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,置培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h.取出小室,用棉簽擦去上室細(xì)胞,PBS洗滌小室3次,以多聚甲醛固定20 min,結(jié)晶紫染色20 min,PBS洗滌數(shù)次,風(fēng)干后在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,觀察并記錄穿膜細(xì)胞數(shù),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.6 Western blot檢測(cè)各組SGC-7901細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平：轉(zhuǎn)染48 h后,收集各組SGC-7901細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液在冰上提取總蛋白.BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度,取30 μg蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,將膜置5%脫脂奶粉中封閉1 h,分別加入一抗4 ℃過(guò)夜孵育,Bax一抗(1：1000),Cleaved Caspase-3一抗(1：1000),β-catenin一抗(1：1000),GSK-3β一抗(1：1000),p-GSK-3β一抗(1：1000),Cyclin D1一抗(1：1000).PBST洗滌3次,每次10 min,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1：3000),室溫孵育2 h.PBST洗滌3次,每次10 min,加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影,以GAPDH為內(nèi)參,使用Image J軟件分析各條帶灰度值,計(jì)算各組SGC-7901細(xì)胞中目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平.

1.2.7 激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)SGC-7901細(xì)胞的影響：為進(jìn)一步探究miR-183通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡侵襲和遷移的生物學(xué)特性,本實(shí)驗(yàn)在過(guò)表達(dá)miR-183的SGC-7901細(xì)胞添加20 mmol/L的Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑LiCl,分別采用MTT、流式細(xì)胞儀、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的變化.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù),所得數(shù)據(jù)均以mean±SD表示,兩組間差異比較采用t檢驗(yàn),多組間差異比較采用單因素方差分析,兩兩組間差異比較采用SNK-q檢驗(yàn)分析,以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 miR-183在胃癌細(xì)胞中呈低表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,與人正常胃黏膜上皮GES-1細(xì)胞相比,4株胃癌SGC-7901、NCI-N87、MKN-28和MKN-45細(xì)胞中miR-183的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05).見(jiàn)圖1.提示miR-183在胃癌細(xì)胞中呈低表達(dá),尤其在SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)水平最低,后續(xù)選取SGC-7901細(xì)胞株進(jìn)行miR-183過(guò)表達(dá)的功能研究.

2.2 SGC-7901細(xì)胞中miR-183 mimics轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) qRTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與Blank組和miR-NC組比,miR-183組SGC-7901細(xì)胞中miR-183表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05).Blank組與miR-NC組比,SGC-7901細(xì)胞中miR-183表達(dá)水平差異無(wú)明顯變化(P＞0.05).見(jiàn)圖2.結(jié)果表明miR-183 mimis轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞能夠上調(diào)miR-183的表達(dá),可滿(mǎn)足后續(xù)miR-183過(guò)表達(dá)的功能研究.

2.3 過(guò)表達(dá)miR-183抑制SGC-7901細(xì)胞增殖能力 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明,與Blank組和miR-NC組比,miR-183組SGC-7901細(xì)胞增殖能力明顯降低(P＜0.05).Blank組與miR-NC組比,SGC-7901細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯改變(P＞0.05).見(jiàn)圖3.說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-183能夠抑制SGC-7901細(xì)胞體外增殖能力.

2.4 過(guò)表達(dá)miR-183促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞儀和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與Blank組和miR-NC組比,miR-183組SGC-7901細(xì)胞凋亡率、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.05).Blank組與miR-NC組比,SGC-7901細(xì)胞凋亡率、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均無(wú)明顯改變(P＞0.05).見(jiàn)圖4.提示過(guò)表達(dá)miR-183能夠促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡.

2.5 過(guò)表達(dá)miR-183抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移能力 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Blank組和miR-NC組比,miR-183組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均明顯減少(P＜0.05).Blank組與miR-NC組比,侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均無(wú)明顯改變(P＞0.05).見(jiàn)圖5.提示過(guò)表達(dá)miR-183能夠抑制SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移能力.

2.6 過(guò)表達(dá)miR-183抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與Blank組和miR-NC組比,miR-183組SGC-7901細(xì)胞中β-catenin、p-GSK-3β和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P＜0.05),GSK-3β蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05),Blank組與miR-NC組比,β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和Cyclin D1表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P＞0.05).見(jiàn)圖6.提示過(guò)表達(dá)miR-183能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活.

2.7 LiCl激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)SGC-7901細(xì)胞的影響 使用Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路后,MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀以及Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與miR-183組比,miR-183+LiCl組SGC-7901細(xì)胞增殖能力升高(t= 6.832,P＜0.05),凋亡率下降(t= 5.24,P＜0.05),侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)增多[t(侵襲) = 7.281,t(遷移) = 7.564,P＜0.05].見(jiàn)圖7.表明miR-183介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移.

圖1 qRT-PCR檢測(cè)不同細(xì)胞株中miR-183的表達(dá)水平.

圖2 轉(zhuǎn)染miR-183 mimis對(duì)SGC-7901細(xì)胞中miR-183表達(dá)的影響.

圖3 過(guò)表達(dá)miR-183對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖能力的影響.

3 討論

目前研究已經(jīng)證明miRNA是致癌過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,例如腫瘤細(xì)胞增殖,分化,侵襲和轉(zhuǎn)移,起到腫瘤抑制劑或癌基因的作用[14,15].因此,闡明miRNA在腫瘤發(fā)展中的潛在機(jī)制可為惡性腫瘤提供有價(jià)值的診斷和治療策略.本實(shí)驗(yàn)探究了miR-183在不同胃癌細(xì)胞株及正常胃黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-183在4種胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)均顯著低于正常胃黏膜上皮細(xì)胞,其中miR-183在胃癌SGC-7901細(xì)胞中表明量降低最為明顯.Cao等[16]研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中miR-183的表達(dá)明顯低于其鄰近正常組織,miR-183的下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理TNM分期密切相關(guān),體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-183通過(guò)調(diào)節(jié)Ezrin在胃癌中起到腫瘤抑制劑的作用.而Li等[17]實(shí)驗(yàn)表明,miR-183可能通過(guò)調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖,凋亡和轉(zhuǎn)移而作為致癌基因起作用,并且miR-183的致癌作用可能與直接靶向PDCD4有關(guān).提示miR-183在胃癌中的作用可能與腫瘤微環(huán)境下調(diào)控的不同靶基因有關(guān).本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-183的SGC-7901細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-183可抑制SGC-7901細(xì)胞體外增殖、侵襲和遷移能力,且能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,表明miR-183在胃癌SGC-7901細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的作用.

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在進(jìn)化上高度保守,在細(xì)胞增殖、分化及黏附等多種細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用[18].多項(xiàng)研究表明,Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[19-21].目前研究已發(fā)現(xiàn)胃癌中Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活,且在胃癌發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[22].β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)因子,被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展中有效的致癌基因.Wnt蛋白作為一種細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)因子,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致GSK-3β蛋白發(fā)生磷酸化,進(jìn)而阻礙β-catenin降解,導(dǎo)致β-catenin累積.當(dāng)β-catenin轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中,將激活下游分子Cyclin D1等的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移等相應(yīng)細(xì)胞學(xué)行為[23].Leung等[24]研究發(fā)現(xiàn),Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活可促進(jìn)高侵襲性肝細(xì)胞癌中miR-183/96/182的表達(dá).最近Yang等[25]研究發(fā)現(xiàn)miR-183通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲.本研究中,過(guò)表達(dá)miR-183后通過(guò)Western blot檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)分子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin、p-GSK-3β和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào),而GSK-3β蛋白表達(dá)水平上調(diào),表明過(guò)表達(dá)miR-183能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活,提示miR-183對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞生物學(xué)特性的影響可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān).為進(jìn)一步探究miR-183通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮作用,本實(shí)驗(yàn)在過(guò)表達(dá)miR-183的SGC-7901細(xì)胞中添加Wnt/β-catenin信號(hào)通路特異性激動(dòng)劑LiCl激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,結(jié)果顯示,LiCl激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-183導(dǎo)致的對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的抑制作用以及對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-183通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡.

圖4 過(guò)表達(dá)miR-183對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響.

圖5 過(guò)表達(dá)miR-183對(duì)SGC-7901細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響.

總之,本研究表明miR-183可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、侵襲和遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,該過(guò)程與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活有關(guān).了解miR-183在胃癌發(fā)病機(jī)制和Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的確切作用有望增加我們對(duì)癌癥發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)的掌握,且還可促進(jìn)針對(duì)胃癌的新治療策略的開(kāi)發(fā).

圖6 SGC-7901細(xì)胞中β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β和Cyclin D1蛋白檢測(cè).

圖7 激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)過(guò)表達(dá)miR-183的SGC-7901細(xì)胞的影響.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

miR-183在胃癌、乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中低表達(dá),發(fā)揮抑癌基因的作用,但其在胃癌中作用機(jī)制目前尚不十分清楚.研究表明,miR-183可以通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲,而Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胃癌中高度激活與胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān).但miR-183是否調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性尚不清楚.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究探討miR-183是否通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移,旨在闡明miR-183在胃癌中的抗癌機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究探討miR-183是否通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移,旨在闡明miR-183在胃癌中的抗癌機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

體外培養(yǎng)人正常胃黏膜細(xì)胞和4中胃癌細(xì)胞系,RT-qPCR檢測(cè)miR-183在各細(xì)胞中的表達(dá)情況.以胃癌SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象,構(gòu)建過(guò)表達(dá)miR-183的胃癌細(xì)胞,MTT法、流式細(xì)胞術(shù)和Transwell實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-183對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-183對(duì)胃癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.使用Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑激活過(guò)表達(dá)miR-183的胃癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路,觀察細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力變化.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

miR-183在4中胃癌細(xì)胞株中均表達(dá)下調(diào).過(guò)表達(dá)miR-183抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制胃癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá).Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑處理過(guò)表達(dá)miR-183的胃癌細(xì)胞后,miR-183對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用減弱,對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用也減弱.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

過(guò)表達(dá)miR-183可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路,抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.

展望前景

本研究?jī)H初步證實(shí)miR-183在胃癌中的抑癌作用可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān),后期將繼續(xù)深入探討miR-183具體與哪個(gè)分子靶向結(jié)合而調(diào)控Wnt/β-catenin通路,在胃癌中發(fā)揮抗癌作用.