韓 偉,馬麗霞

（韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東 韶關(guān)512005）

杜鵑紅山茶（Camellia changii）是山茶科山茶屬植物，與山茶、油茶、茶等植物同科同屬.杜鵑紅山茶花似山茶葉像杜鵑，花大而鮮艷，一年四季都能開花，俗稱“四季茶”，與普通的山茶相比具有極高的觀賞價(jià)值.杜鵑紅山茶是山茶科中的一個(gè)極其珍稀的品種，其自然種群分部狹窄，目前僅見于廣東省陽春縣河尾山，結(jié)實(shí)率和種子萌發(fā)率都很低，一度曾瀕臨滅絕，有“植物界大熊貓”之稱，該種已被《中國物種紅色名錄》列為極危種［1］.因此，為了更好的保護(hù)這一珍貴的植物資源，對杜鵑紅山茶快速繁殖技術(shù)的研究迫在眉睫.

杜鵑紅山茶繁殖的研究目前主要集中在傳統(tǒng)的人工扦插［2-4］和嫁接繁殖［5-7］方面，而利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對其進(jìn)行繁殖的研究報(bào)道較少［8-12］.如將杜鵑紅山茶的幼嫩的莖段在無菌條件下進(jìn)行繁殖，預(yù)期獲得大量種苗，為生產(chǎn)花卉的企業(yè)提供大量的苗木，進(jìn)而為地方經(jīng)濟(jì)建設(shè)服務(wù).同時(shí)也為探索木本花卉快速繁殖提供借鑒.但是杜鵑紅山茶屬于山茶科植物，該科植物體中通常含有大量的酚類化合物，木質(zhì)素、單寧或色素，所以在組織培養(yǎng)過程中極易導(dǎo)致外植體發(fā)生裼變，部分細(xì)胞也會因褐變物質(zhì)的毒害而死亡，且內(nèi)外生菌的污染對誘導(dǎo)分化產(chǎn)生了一定的影響.筆者利用植物組培技術(shù)對杜鵑紅山茶的繁殖進(jìn)行了探討，主要從不同激素配比對杜鵑紅山茶葉片和莖段愈傷組織的影響進(jìn)行探討，又關(guān)注了外植體污染和褐化的問題，旨在為其組織培養(yǎng)技術(shù)提供參考.

1 材料和方法

1.1 材料 于天氣晴朗的上午8:00～10:00時(shí)剪取杜鵑紅山茶（用于植株嫁接，見圖1-A）上的幼嫩的葉片和帶側(cè)芽的莖段（剛抽出不久，半木質(zhì)化）.

1.2 培養(yǎng)條件 以MS為基本培養(yǎng)基，按表1激素配比配制培養(yǎng)基（瓊脂7.5 g/L，蔗糖30 g/L，pH 5.8，121℃高壓滅菌 20 min）.培養(yǎng)溫度 26±1℃，濕度 70%～80%，光照時(shí)間 16 h/d，光照強(qiáng)度 1 500～2 000 lx，20 d 繼代 1 次.

1.3 外植體的預(yù)處理 從杜鵑紅山茶母株上剪取較嫩的葉片，側(cè)芽和頂芽飽滿的新梢后，用流水反復(fù)沖洗1 h，洗去表面污物后用洗衣粉仔細(xì)清洗，再用清水沖洗、半涼干，放置在燒杯中用1.4 g/L抗壞血酸浸泡1 h.

圖1 杜鵑紅山茶的組織培養(yǎng)

1.4 外植體接種

將取材多余的部分進(jìn)行裁剪，待接種的外植體在75%的酒精中表面消毒30 s，雙蒸水沖洗3～5次；再置于0.1%的氯化汞中消毒9 min，雙蒸水洗滌4～6次；消毒好的外植體置于濾紙上晾干表面水分并準(zhǔn)備接種.將葉片切成約0.7～1 cm的小塊，將帶側(cè)芽的莖段切成1.0～1.5 cm的小段，每段留1～2個(gè)芽，分別接種培養(yǎng)基上（見表1），每種培養(yǎng)基分別接葉片、莖段各30瓶，每瓶接種2～3個(gè)外植體，觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率.另外，將杜鵑紅山茶帶側(cè)芽的莖段作為外植體接于MS+6-BA 1 mg/L+IBA 0.01 mg/L+GA3 10 mg/L［8］或MS+6-BA 1 mg/L+IBA 0.01 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，觀察側(cè)芽的萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率.

表1 誘導(dǎo)愈傷組織的不同激素配比/（mg/L）

2 結(jié)果和分析

2.1 培養(yǎng)基中的激素配比對杜鵑紅山茶葉片和莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將杜鵑紅山茶的葉片、莖段接種于表1中的培養(yǎng)基上后，葉片和莖段都能誘導(dǎo)出愈傷組織.觀察發(fā)現(xiàn)在葉片和莖段分別培養(yǎng)13，15 d出現(xiàn)愈傷組織.培養(yǎng)30 d后，葉片在不同激素組合中愈傷組織的狀態(tài)有較大差別：在含有NAA的培養(yǎng)基上，愈傷組織顏色發(fā)黃，較致密（見圖1-B）；而在含有IBA的培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色為白色或淡綠色，較為疏松（見圖1-C）.莖段誘導(dǎo)出的愈傷組織致密并帶紅色（見圖1-D）.與其它激素配比相比，葉片和莖段在6-BA/IBA或者6-BA/NAA配比為1∶1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率較高，當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)、IBA或NAA濃度相對低時(shí)，莖段愈傷組織的誘導(dǎo)率相對較高（見表 2）.葉片在MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為52.3%，莖段在MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為56.8%.

表2 不同激素配比對杜鵑紅山茶葉片和莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 培養(yǎng)基中的激素配比對杜鵑紅山茶帶側(cè)芽的莖段上芽萌發(fā)的影響

當(dāng)把杜鵑紅山茶帶側(cè)芽的莖段接種到兩種不同的培養(yǎng)基上（見表3），培養(yǎng)15 d后，可觀察到莖段上的側(cè)芽和頂芽有萌動(dòng)的現(xiàn)象，芽周圍的葉柄脫落，芽苞開始膨大（見圖1-E）.培養(yǎng)30 d后可以看到葉片長出（見圖1-F）.莖段的基部沒有看到愈傷組織產(chǎn)生.培養(yǎng)基中添加GA3后，芽的萌發(fā)率可達(dá)到57.1%，沒有添加GA3的培養(yǎng)基芽的萌發(fā)率只達(dá)到46.4%，說明培養(yǎng)基中添加GA3有利于杜鵑紅山茶莖段上芽的萌發(fā).

表3 不同的激素配比對杜鵑紅山茶帶側(cè)芽的莖段上芽萌發(fā)的影響

3 討論

3.1 培養(yǎng)基中的激素配比對誘導(dǎo)愈傷組織的影響

植物愈傷組織的誘導(dǎo)中，激素的濃度和種類起著重要作用.山茶科植物常用的誘導(dǎo)愈傷組織的激素有2,4-D、6-BA、NAA和IBA［13-16］.實(shí)驗(yàn)研究究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素/生長素配比為1∶1時(shí)較適宜誘導(dǎo)杜鵑紅山茶的愈傷組織，但石蘭蓉［12］研究結(jié)果表明MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L是杜鵑紅山茶愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，其細(xì)胞分裂素/生長素配比為1:4，與本文結(jié)果有不同之處，可能是由外植體生理年齡及生長狀態(tài)不同導(dǎo)致的.培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L適宜誘導(dǎo)葉片的愈傷組織的產(chǎn)生，誘導(dǎo)率最高為52.3%，NAA在葉片的愈傷組織誘導(dǎo)中的效果優(yōu)于IBA；培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 1.0 mg/L中莖段的愈傷組織誘導(dǎo)率最高為56.8%，而IBA在莖段的愈傷組織誘導(dǎo)中的效果優(yōu)于NAA.可見，不同的外植體在愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)所需的激素種類及濃度均不同.

杜鵑紅山茶莖段在MS+BA 1 mg/L+IBA 0.01 mg/L+GA3 10 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d，芽萌發(fā)率可高達(dá)57.1%，與沒有添加GA3的培養(yǎng)基相比，芽的萌發(fā)率較高，說明GA3在杜鵑紅山茶莖段上芽的萌發(fā)時(shí)起著重要的作用，有利于芽的萌發(fā)，提高芽的萌發(fā)率.另外，GA3通常在植物組織培養(yǎng)中用作促進(jìn)芽伸長的一種激素［17］.因此，考慮在木本植物的組織培養(yǎng)中添加一定量的GA3，可促進(jìn)芽的萌發(fā)和伸長，加快芽的生長速度.本文所得到杜鵑紅山茶莖段上的芽萌發(fā)率57.1%低于蔡靜如等［8］研究的結(jié)果(芽的萌發(fā)率可達(dá)到68%)，原因可能是采取的外植體生理年齡不同，本文采取的是嫁接植株上的杜鵑紅山茶莖段，而前人采用的是實(shí)生苗上的莖段.

3.2 污染探討

有效控制微生物污染是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵技術(shù)之一.山茶科植物組織培養(yǎng)中污染的原因主要由外植體、培養(yǎng)基和無菌操作3個(gè)方面引起的，其中以外植體方面的污染最復(fù)雜，也最難控制.外植體的污染主要由表面消毒不徹底和內(nèi)生菌造成的，通常接種之后的一周就會表現(xiàn)出來.試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)杜鵑紅山茶的組織培養(yǎng)中外植體的污染主要由內(nèi)生菌造成的.本文通過外植體接種前的預(yù)處理，取材時(shí)選用剛抽生的新梢及縮短繼代的時(shí)間，有效的降低了外植體內(nèi)生菌的污染率.

3.3 外植體褐化

外植體褐化主要是因?yàn)椴杞M織分泌的多酚類物質(zhì)被氧化所致.由于山茶科植物組織中酚類物質(zhì)含量較高，當(dāng)酚類化合物含量高時(shí)，木質(zhì)素、單寧或色素形成就多，易導(dǎo)致褐變的發(fā)生，有些細(xì)胞會因褐變而死亡［18］.杜鵑紅山茶葉片和莖段在培養(yǎng)過程中都有褐化的現(xiàn)象，切口褐化對愈傷組織生長會產(chǎn)生不利影響.若是局部褐化，對愈傷組織的誘導(dǎo)影響較小，全部褐化會導(dǎo)致外植體快速死亡，阻礙愈傷組織的誘導(dǎo).與葉片、腋芽、頂芽比較，莖段的褐化現(xiàn)象較輕.同時(shí)發(fā)現(xiàn)添加吸附劑(如活性碳)和添加抗氧化劑（如PVP）的培養(yǎng)基，或是外植體經(jīng)過Vc浸泡處理的，外植體褐化現(xiàn)象較輕，褐變得到一定控制；沒有處理的培養(yǎng)基褐化較嚴(yán)重.