楊潮，戴京，張欣宇，陳慧

贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000

轉(zhuǎn)錄因子在真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要手段之一。人叉頭框蛋白是一類富含轉(zhuǎn)錄因子且廣泛分布于多種組織細(xì)胞中的蛋白家族，最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。該家族蛋白具有多種生物學(xué)功能，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控和生理代謝中發(fā)揮重要作用[1-2]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)叉頭框家族成員表達(dá)異常與人體多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如卵巢疾病、多種惡性腫瘤等疾病[3-4]。

轉(zhuǎn)錄因子FoxM1B是叉頭框蛋白家族的一員，具有該家族典型的翼狀螺旋結(jié)構(gòu)[5]。FoxM1B主要通過(guò)招募共激活因子和轉(zhuǎn)錄基本因子共同作用來(lái)激活相應(yīng)的靶基因，在細(xì)胞的多種生理和病理活動(dòng)中發(fā)揮作用。在細(xì)胞增殖中，F(xiàn)oxM1B可與一系列G2和M期相關(guān)基因的啟動(dòng)子結(jié)合并進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞周期中各時(shí)相的轉(zhuǎn)換[6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)FoxM1B與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，不僅能夠促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）影響癌細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等過(guò)程，還與腫瘤耐藥、抵抗化療和患者預(yù)后不良相關(guān)[7-8]。因此，轉(zhuǎn)錄因子FoxM1B是癌癥治療的潛在靶基因和藥物靶標(biāo)。我們利用生物信息學(xué)方法，對(duì)人轉(zhuǎn)錄因子FoxM1B的基因及其編碼蛋白的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，為了解FoxM1B的相關(guān)性質(zhì)和機(jī)制提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

登陸NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索人（HOMO）的FoxM1B基因，獲得其全長(zhǎng)基因序列（Gene ID：2305）和氨基酸序列（NP_001230017），并存為FASTA格式，利用表1所列軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

表1 在線生物信息學(xué)軟件

2 結(jié)果與分析

2.1 人FoxM1B基因序列分析

人FoxM1B基因全長(zhǎng)19 475 bp，位于12號(hào)染色體，包括10個(gè)編碼區(qū)，分別位于1～236、2631～3179、4909～5060、8402～8593、10635～10763、11757～11801、12404～12473、12661～12836、15744～15857、17493～19475，可編碼748個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為82 742.10，屬于親水性蛋白。

2.2 人FoxM1B基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)

用3種啟動(dòng)子分析軟件對(duì)人FoxM1B基因5'側(cè)翼2000 bp序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，所得結(jié)果存在差異（表2）。Network Promoter Prediction分析發(fā)現(xiàn)在人FoxM1B基因5'側(cè)翼1543～1593 bp位置存在1個(gè)啟動(dòng)子，分值為0.97。FPROM預(yù)測(cè)表明在1349 bp存在1個(gè)啟動(dòng)子，1315 bp存在1個(gè)TATA盒。Promoter 2.0則預(yù)測(cè)出人FoxM1B基因啟動(dòng)子區(qū)域有2個(gè)，分別位于900和1700 bp，均為臨界性預(yù)測(cè)。

對(duì)FoxM1B基因5'側(cè)翼2000 bp進(jìn)行甲基化CpG島圖譜預(yù)測(cè)，MethPrimer預(yù)測(cè)表明在1299～1894 bp存在596 bp的甲基化CpG島，EMBOSS預(yù)測(cè)出長(zhǎng)度為613 bp的甲基化CpG島位于1331～1943 bp（圖1）。2種軟件預(yù)測(cè)的甲基化CpG島位置存在重疊，所以本次啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果具有一定的準(zhǔn)確性。

表2 人FoxM1B基因啟動(dòng)子預(yù)測(cè)

圖1 FoxM1B基因甲基化CpG島圖譜

2.3 人FoxM1B蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

由于外顯子剪接的不同，F(xiàn)oxM1基因產(chǎn)生了3個(gè)不同的亞型FoxM1A、FoxM1B和FoxM1C，其中只有FoxM1B、FoxM1C具有轉(zhuǎn)錄活性，而FoxM1A因會(huì)導(dǎo)致活性區(qū)域的斷裂而不具有轉(zhuǎn)錄活性。研究多集中于FoxM1B，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子FoxM1B的分析將有助于更好地理解人體中的基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程及其相應(yīng)的作用機(jī)制，進(jìn)而為癌癥的研究和治療提供新的理論依據(jù)和方案。Protparam預(yù)測(cè)人FoxM1B蛋白的理化性質(zhì)見表3。

2.3.1 FoxM1B蛋白親疏水性分析 Protscale計(jì)算FoxM1B蛋白質(zhì)親疏水性分布圖，結(jié)果如圖2。用Hphob/Kyte&Doolittle算法分析，橫坐標(biāo)示氨基酸位置，縱坐標(biāo)示標(biāo)度得分，＜0表示親水，＞0表示疏水，結(jié)果顯示親水性肽段分布于整個(gè)氨基酸序列，且親水性肽段明顯多于疏水性肽段?？傮w分析而言，轉(zhuǎn)錄因子FoxM1B親水性氨基酸較多，由此推測(cè)此蛋白為親水性蛋白。Protparam預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其蛋白平均疏水指數(shù)為-0.616，說(shuō)明也有一定數(shù)量的疏水性氨基酸，這些氨基酸通過(guò)疏水作用聚集到蛋白質(zhì)顆粒的中間部位，親水部位則分布在外，有利于其在細(xì)胞中的穩(wěn)定性。

表3 人FoxM1B蛋白理化性質(zhì)分析表

圖2 FoxM1B蛋白親疏水性分析

2.3.2 跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與信號(hào)肽分析 TMHMM 2.0軟件分析表明人FoxM1B不含跨膜區(qū)，說(shuō)明其不是跨膜蛋白（圖3A）。信號(hào)肽是分泌性蛋白質(zhì)多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)位的N端氨基酸序列，一般由15～30個(gè)氨基酸殘基組成。用SignalP 4.1軟件對(duì)人FoxM1B進(jìn)行分析（圖3B），發(fā)現(xiàn)所有氨基酸的C值、S值、Y值均遠(yuǎn)低于平均值0.5，說(shuō)明人FoxM1B不含信號(hào)肽，為非分泌性蛋白。事實(shí)上人FoxM1B作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，需要進(jìn)入細(xì)胞核與DNA相應(yīng)區(qū)域結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，上述預(yù)測(cè)結(jié)果與這一描述在理論上是相符合的。

圖3 FoxM1B蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

2.4 人FoxM1B蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用SOPMA工具對(duì)FoxM1B蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果如圖4，不同顏色的豎線表征不同的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中藍(lán)色豎線為α螺旋，紅色豎線為延伸鏈，綠色豎線為β轉(zhuǎn)角，紫色豎線為無(wú)規(guī)卷曲。FoxM1B蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有18.98%的α螺旋、10.56%的延伸鏈和2.41%的β轉(zhuǎn)角，其余68.05%氨基酸殘基均處于無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)。無(wú)規(guī)卷曲為FoxM1B蛋白的主要折疊形式，而α螺旋占比相對(duì)較少，可能不利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。

2.4.1 模體預(yù)測(cè) 模體（motif）是一種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，是蛋白中具有特定空間構(gòu)象和特定功能的結(jié)構(gòu)成分。用NCBI的Conserved Domain Search Service（CD Search）軟件，輸入FoxM1B的氨基酸序列，獲得該蛋白質(zhì)的模體預(yù)測(cè)結(jié)果，包含翼螺旋結(jié)構(gòu)（FH）和 herpesvirus_ICP4_C super familiy結(jié)構(gòu)（圖5）。翼螺旋結(jié)構(gòu)是其DNA結(jié)合區(qū)，也是Fox蛋白家族的典型特征。

圖4 FoxM1B蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖5 FoxM1B蛋白的模體結(jié)構(gòu)

2.4.2 結(jié)構(gòu)域與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄時(shí)需要與多種輔助因子相互作用形成復(fù)合物共同參與調(diào)節(jié)，因此分析FoxM1B蛋白互作對(duì)指導(dǎo)其功能研究具有重要意義。運(yùn)用Smart軟件預(yù)測(cè)的FoxM1B蛋白結(jié)構(gòu)域和相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果如圖6。FoxM1B蛋白234～321位氨基酸殘基對(duì)應(yīng)一個(gè)FH結(jié)構(gòu)域；FoxM1B與多種蛋白質(zhì)相互作用，圖6給出了得分前10位的相互作用蛋白質(zhì)。

2.4.3 蛋白信息預(yù)測(cè) 對(duì)FoxM1B蛋白信息預(yù)測(cè)結(jié)果見圖7，該蛋白存在9個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，缺少多核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，有3個(gè)螺旋區(qū)域。

2.4.4 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其生物功能，因此解析蛋白質(zhì)高級(jí)空間結(jié)構(gòu)有利于對(duì)其具體的生物學(xué)功能進(jìn)行分析和理解。運(yùn)用Swiss-model構(gòu)建FoxM1B蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，得到3個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)模型Model01、Model02、Model03，3個(gè)模型的氨基酸序列相似性分別為99.20%、45.83%、43.82%。根據(jù)序列相似性的比較，選擇Model01作為FoxM1B的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行后續(xù)分析，結(jié)果如圖8。在目標(biāo)模板對(duì)準(zhǔn)結(jié)合性質(zhì)的質(zhì)量估計(jì)（Global Model Quality Estimation，GMQE）中，所得分值為0.07，處于合理范圍（GMQE：0～1）；在綜合計(jì)分功能的全局分析和局部模型的質(zhì)量分析估計(jì)（Qualitative Model Energy Analysis，QMEAN）中，所得分值為-0.29，表明該模型與實(shí)驗(yàn)中所得到的結(jié)構(gòu)具有較好的相似性。在三級(jí)結(jié)構(gòu)模型中可以明顯看到α螺旋和β轉(zhuǎn)角相對(duì)較少，存在大量無(wú)規(guī)卷曲，預(yù)測(cè)結(jié)果與用SOPMA軟件預(yù)測(cè)的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)性質(zhì)吻合。

圖6 FoxM1B蛋白的功能域預(yù)測(cè)（A）和相互作用分析（B）

圖7 FoxM1B蛋白信息預(yù)測(cè)

3 討論

人FoxM1B基因5'側(cè)翼存在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及啟動(dòng)子，且啟動(dòng)子的側(cè)翼有1個(gè)CpG島。人FoxM1B蛋白包含748個(gè)氨基酸殘基，理論等電點(diǎn)8.57，脂肪系數(shù)75.24，半衰期30 h，不穩(wěn)定系數(shù)77.76超過(guò)40，總平均疏水性-0.616為負(fù)值，表明該蛋白是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明FoxM1B蛋白既無(wú)信號(hào)肽，又無(wú)跨膜區(qū)域，存在9個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，缺少多核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，有3個(gè)螺旋區(qū)域，無(wú)規(guī)則卷曲為其主要折疊形式。運(yùn)用Swiss-model構(gòu)建FoxM1B蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，表明該蛋白含有1個(gè)FH結(jié)構(gòu)域，并可能與一些蛋白存在物理性的相互作用。

目前對(duì)于FoxM1B的功能研究多集中于癌癥。研究發(fā)現(xiàn)FoxM1B在多種惡性腫瘤細(xì)胞和臨床樣本中高表達(dá)[9-10]，并且通過(guò)促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化、抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑等多種途徑，影響周期蛋白或周期蛋白依賴性蛋白激酶的活性，還可通過(guò)生長(zhǎng)激素來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤的惡性生長(zhǎng)[11-12]。FoxM1B還被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控上皮標(biāo)志物（E-cadherin）和間質(zhì)標(biāo)志物（Snail、N-cadherin、Slug）的表達(dá)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要意義[13-15]。此外還有研究報(bào)道FoxM1B能夠促進(jìn)Rad51的表達(dá)進(jìn)而增加腫瘤細(xì)胞的耐藥性和化療抵抗，成為患者預(yù)后差的一個(gè)主要因素[8,16]。越來(lái)越多的研究表明FoxM1B可以作為癌癥治療的靶點(diǎn)，因此研發(fā)FoxM1B的抑制劑成為治療癌癥的有力手段。

圖8 FoxM1B蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

本研究從人FoxM1B基因序列出發(fā)，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)分析了人FoxM1B蛋白的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)與功能特征。該部分的工作為進(jìn)一步探索人FoxM1B的生物學(xué)功能提供了一定的依據(jù)和線索，奠定了重要的信息基礎(chǔ)。