馮帆，姜棋予，孫慧偉，王祥喜，申立軍，辛紹杰，李伯安

1.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 a.臨床檢驗醫(yī)學(xué)中心，b.臨床研究管理中心，c.肝臟衰竭診療中心，北京 100039；2.中國科學(xué)院 生物物理研究所，北京 100101

目前，病毒性肝炎不僅嚴(yán)重危害我國人民的身體健康，也對我國公共衛(wèi)生事業(yè)構(gòu)成巨大挑戰(zhàn)。Polaris Observatory Collaborators于2018年撰文，系統(tǒng)分析和總結(jié)了全球病毒性肝病的最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)，我國有超過8000萬人攜帶乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）或罹患HBV相關(guān)的慢性肝病，這些患者中有相當(dāng)比例最終會進(jìn)展為肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），因此研究和開發(fā)高效的HCC治療策略具有重要意義[1]。受診療技術(shù)的限制，絕大多數(shù)HCC患者初診即為進(jìn)展期（advanced HCC），目前抗腫瘤藥物治療策略主要是口服以多靶標(biāo)蛋白激酶抑制劑索拉非尼為代表的分子靶向藥物[2]。盡管目前對進(jìn)展期HCC進(jìn)行分子靶向治療能夠延長患者生存期，改善患者生存質(zhì)量，但仍存在諸多問題。以索拉非尼為例，分子靶向治療的臨床獲益在患者個體間存在較大差異，只有25%～40%的患者對索拉非尼敏感，隨著持續(xù)服用藥物，大多數(shù)一開始對分子靶向藥物敏感的患者會出現(xiàn)耐藥[3]，而瑞戈非尼和樂伐替尼/侖伐替尼等新型分子靶向藥物進(jìn)入臨床應(yīng)用的時間較短[4]，隨著臨床診療，也可能會有耐藥等相關(guān)報道。

孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）是一種重要的核受體，蛋白結(jié)構(gòu)特征是具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DBD）及配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ligand binding domain，LBD）[5]。與雌激素受體等其他類型的核受體不同[6]，PXR不具有配體非依賴的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AF-1，僅具有包含在LBD中的配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AF-2，因此與配體或激動劑結(jié)合是PXR轉(zhuǎn)錄因子活性的重要調(diào)節(jié)因素。分子靶向藥物索拉非尼能夠作為配體/激動劑活化PXR進(jìn)而誘導(dǎo)PXR的各類下游基因（包括各類藥物代謝酶及耐藥蛋白基因等）表達(dá)，通過這些代謝相關(guān)蛋白加速抗腫瘤藥物自身的代謝與清除等過程，影響其對HCC的治療效果[7-8]。因此，PXR介導(dǎo)的索拉非尼的代謝與清除機(jī)制可能是HCC對藥物耐受的根本來源和特異性機(jī)制。

前期研究結(jié)果顯示，用PXR的激動劑（利福霉素）處理細(xì)胞能夠誘導(dǎo)PXR下游耐藥相關(guān)基因的表達(dá)、加速索拉非尼的代謝與清除作用，最終上調(diào)HCC細(xì)胞對索拉非尼的耐藥；而使用PXR拮抗劑（酮康唑）處理HCC細(xì)胞能夠下調(diào)PXR的轉(zhuǎn)錄因子活性、PXR下游耐藥基因的表達(dá)，延緩索拉非尼在HCC細(xì)胞中的代謝與清除作用，最終下調(diào)HCC細(xì)胞對索拉非尼的耐藥，增加HCC細(xì)胞對索拉非尼的敏感性[1-2]。這表明，PXR是逆轉(zhuǎn)HCC分子靶向治療耐藥的干預(yù)靶標(biāo)，研究與開發(fā)PXR的拮抗劑有助于延緩HCC細(xì)胞對索拉非尼的代謝與清除作用，實現(xiàn)更為有效的HCC分子靶向治療。本研究旨在利用X線晶體衍射技術(shù)，獲得PXR配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)，為研究和開發(fā)靶向PXR的全新藥物奠定堅實基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）菌株、pRSFDuet-1表達(dá)載體由中國科學(xué)院生物物理研究所王祥喜研究員惠賜；PXR-LBD序列的化學(xué)合成及表達(dá)載體的構(gòu)建由濟(jì)南維真公司完成；DNA聚合酶、限定性內(nèi)切酶等購自NEB公司；PCR、DNA分離純化等試劑盒購自Promega公司；DNA marker、瓊脂糖等試劑購自北京全式金公司；X線衍射儀及數(shù)據(jù)分析工作站由中國科學(xué)院生物物理研究所王祥喜研究員提供；PCR儀、DNA電泳槽、紫外采像儀等購自ABI公司。

1.2 基因合成與分子克隆

構(gòu)建含有PXR-LBD（PXR蛋白130～434氨基酸殘基截短體）的表達(dá)載體[9]。首先對基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后再進(jìn)行化學(xué)合成，獲得PXR-LBD區(qū)域的序列。在化學(xué)合成PXR-LBD時，將限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ序列加入PXD-LBD片段兩端，在此基礎(chǔ)上用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切PXRLBD片段及pRSFDuet-1載體，再將PXR-LBD片段與載體按10∶1混合，16℃孵育2 h，4℃孵育過夜，最終獲得含有PXR-LBD序列的pRSFDuet-1載體。對PXR基因序列進(jìn)行大腸桿菌表達(dá)密碼子優(yōu)化后氨基酸殘基序列如下：

1.3 PXR蛋白的原核表達(dá)

將插入PXR基因的pRSFDuet-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)菌株，驗證陽性克隆，保菌凍存于-80℃。將表達(dá)菌按1∶1000接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基小瓶中，37℃搖床上過夜培養(yǎng)，次日將擴(kuò)增的小瓶接入LB大瓶進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。為了防止蛋白錯誤折疊形成包涵體，待菌體D600nm值達(dá)到0.6左右時，將培養(yǎng)溫度降至16℃，并加入0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)目的蛋白低溫表達(dá)，16～20 h后4000 r/min離心40 min收集菌體，棄上清，加入緩沖液［20 mmol/L Tris（pH7.8），100 mmol/L NaCl，5%甘油］重懸菌體，凍存于-80℃。用超聲波破碎儀充分破碎大腸桿菌菌體，16 000 r/min離心40 min收集上清。

1.4 PXR蛋白的分離純化

由于表達(dá)的PXR蛋白具有載體自帶的組氨酸標(biāo)簽，故可通過Ni-NTA親和層析的方法對目的蛋白進(jìn)行純化。將Ni-NTA親和層析柱灌入10倍柱體積左右的純化緩沖液［20 mmmol/L Tris（pH7.8），100 mmmol/L NaCl，5%甘油］進(jìn)行平衡，用恒流泵將破菌后的離心上清加入Ni-NTA親和層析柱，反復(fù)通過Ni-NTA親和層析柱3次，使PXR蛋白充分結(jié)合Ni-NTA介質(zhì)。Ni-NTA親和層析柱結(jié)合結(jié)束后，加入純化緩沖液沖掉剩余未結(jié)合的蛋白，繼續(xù)用洗雜緩沖液［20 mmmol/L Tris（pH7.8），100 mmmol/L NaCl，5%甘油，20 mmmol/L咪唑］沖洗柱子，可將大部分非特異性結(jié)合的雜蛋白洗掉。洗去雜蛋白后，加入含有高濃度咪唑的洗脫緩沖液［20 mmmol/L Tris（pH7.8），100 mmmol/L NaCl，5%甘油，250 mmmol/L咪唑］可將目的蛋白從親和柱洗脫。為了進(jìn)一步提高蛋白純度，繼續(xù)使用凝膠排阻層析技術(shù)對蛋白進(jìn)一步純化。將分子篩Superdex75用純化緩沖液［20 mmmol/L Tris（pH7.8），100 mmmol/L NaCl，5%甘油］平衡，用30kD超濾管對洗脫緩沖液洗脫的目的蛋白進(jìn)行濃縮，將濃縮后的樣品（約500 μL）上樣Superdex75層析柱，對蛋白峰進(jìn)行分管收集，再進(jìn)行質(zhì)譜檢測，確定蛋白表達(dá)是否正確。

1.5 PXR蛋白結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析

用30kD濃縮管將分子篩純化后的PXR蛋白濃縮至5 mg/mL，用Hampton等公司的晶體篩選試劑盒對蛋白進(jìn)行結(jié)晶條件篩選與優(yōu)化。采用懸滴法，于20℃恒溫恒濕環(huán)境下初步篩選到PXR蛋白結(jié)晶條件，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行pH、鹽濃度、沉淀劑濃度等的條件優(yōu)化。優(yōu)化后的晶體生長條件為80 mmmol/L咪唑（pH7.5）、100 mmmol/L Na-Cl、10%異丙醇，最終確定獲得高質(zhì)量的PXR蛋白晶體。以甘油作為防凍劑，在上海同步輻射光源收集晶體衍射數(shù)據(jù)，參考PDB 1NRL的研究作為初始模型，采用CCP4程序包中的Phaser軟件，利用分子置換方法解析該蛋白質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)，最后用Phenix.refine軟件和COOT軟件對結(jié)構(gòu)進(jìn)行修正，確證所得蛋白三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的分辨率，并保證各項指標(biāo)均在合理范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1 PXR蛋白的分離純化

首先構(gòu)建了PXR-LBD的表達(dá)載體（圖1A），其中載體條帶約為3000 bp，目標(biāo)基因條帶（PXR-LBD）為750～1000 bp。在此基礎(chǔ)上對親和層析結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE分析，在含250 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液的洗脫樣品中有大量目的蛋白（圖1B）。凝膠排阻層析結(jié)果顯示目的蛋白性質(zhì)均一，根據(jù)出峰位置判斷蛋白應(yīng)為單體形式存在，無聚集形式的蛋白（圖2）。在此基礎(chǔ)上，對分子篩吸收峰對應(yīng)管號為3～11的樣品進(jìn)行SDSPAGE分析，結(jié)果顯示樣品5～9管為純度較高、均一的PXR目的蛋白（圖3）。切割SDS-PAGE凝膠對上述蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示最終純化獲得的蛋白即為目的蛋白PXR，且匹配的肽段顯示PXR蛋白無降解現(xiàn)象（圖4）。

圖1 PXR-LBD表達(dá)載體的鑒定及PXR-LBD蛋白Ni-NTA親和層析SDS-PAGE分析

圖2 PXR-LBD蛋白Superdex75分子篩純化結(jié)果

圖3 PXR-LBD蛋白經(jīng)Superdex75純化后的SDS-PAGE分析

圖4 純化的PXR-LBD蛋白SDS-PAGE條帶的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.2 PXR蛋白晶體三維結(jié)構(gòu)的X線衍射解析

采用懸滴法，于20℃恒溫恒濕環(huán)境下得到PXR-LBD晶體（圖5A、B）。對初步篩選到的結(jié)晶條件進(jìn)行pH、鹽濃度、沉淀劑濃度等條件優(yōu)化，最終獲得能夠進(jìn)行X線衍射數(shù)據(jù)收集的高質(zhì)量蛋白晶體（圖5C、D）。所得PXR-LBD蛋白晶體形狀規(guī)則，質(zhì)量較高。在此技術(shù)上對PXR蛋白晶體進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，結(jié)果如圖6，所得蛋白晶體X線衍射的分辨率可達(dá)2.8 ?。進(jìn)一步用HKL2000軟件包對收集的衍射數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，經(jīng)過指標(biāo)化、積分和scale，最后確定晶體空間群為P212121。圖7為PXR蛋白LBD區(qū)域平視和俯視視角的帶-環(huán)（band-loop）結(jié)構(gòu)圖，顯示出PXR-LBD的8個α螺旋結(jié)構(gòu)與相應(yīng)轉(zhuǎn)角（loop）。圖8為PXR-LBD的電子密度圖，顯示LBD蛋白肽鏈骨架和電子密度。

圖5 PXR-LBD蛋白結(jié)晶結(jié)果

圖6 PXR-LBD蛋白晶體X線衍射圖

圖7 解析的PXR-LBD蛋白晶體整體結(jié)構(gòu)

圖8 PXR-LBD晶體結(jié)構(gòu)中配體結(jié)合袋（ligand-binding pocket）附近的電子密度（1.5σ）

3 討論

PXR是重要的核受體，最初僅被認(rèn)為是類固醇激素受體[7]。隨著研究的拓展，多種內(nèi)/外源藥物/毒物都可作為PXR的配體/激動劑，這些藥物或毒物能夠活化PXR，誘導(dǎo)代謝酶及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)[7]。活化的PXR與維甲酸X受體形成異源二聚體從細(xì)胞質(zhì)遷移進(jìn)入細(xì)胞核，與其下游基因啟動子區(qū)/增強(qiáng)子區(qū)所包含的PXR結(jié)合元件結(jié)合，最終介導(dǎo)其下游基因的轉(zhuǎn)錄[7]。PXR的下游基因種類多樣、作用廣泛，主要包括多藥耐藥基因-1和乳腺癌耐藥蛋白等各類耐藥蛋白（即藥物Ⅲ相代謝酶/藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體）、CYP 3A4等多種亞型的細(xì)胞色素氧化酶（即藥物Ⅰ相代謝酶/藥物氧化代謝酶）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶等基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶（即藥物Ⅱ相代謝酶/基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶）[7]。各種抗腫瘤藥物能夠?qū)CC細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，因此抗腫瘤藥物既是外源性藥物，又是外源性毒物。PXR作為肝臟對外源性藥物和毒物代謝與解毒機(jī)制的調(diào)控樞紐，各種抗腫瘤藥物有可能作為配體/激動劑活化PXR，進(jìn)而誘導(dǎo)PXR的各類下游基因（包括各類藥物代謝酶及耐藥蛋白等）表達(dá)，最終通過這些代謝相關(guān)蛋白加速抗腫瘤藥物的代謝與清除等過程，最終影響HCC的治療效果。由于肝臟是人體代謝的中心，而HCC細(xì)胞具有更為旺盛的物質(zhì)攝取和代謝特性，因此PXR介導(dǎo)的抗腫瘤藥物的代謝與清除機(jī)制可能是HCC對抗腫瘤藥物多藥耐藥的根本來源和特異性機(jī)制。這表明，研究和開發(fā)PXR的拮抗劑具有重要意義。但現(xiàn)有藥物研究存在較大不足，體現(xiàn)在：以利福平為代表的多種藥物被確認(rèn)為PXR的激動劑或明確其具有誘導(dǎo)PXR轉(zhuǎn)錄的作用，但關(guān)于PXR拮抗劑的報道極少，僅酮康唑一種藥物被用作PXR的拮抗劑；現(xiàn)有研究主要關(guān)注PXR的藥代動力學(xué)、藥物相互作用，其作為抗腫瘤干預(yù)靶標(biāo)的研究極少；目前未有依據(jù)PXR設(shè)計小分子化合物拮抗劑的研究報道，而獲得PXR的高分辨率三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)是設(shè)計與研發(fā)PXR特異性拮抗劑的基礎(chǔ)。我們解析了PXR-LBD的晶體結(jié)構(gòu)，不僅有助于PXR相關(guān)研究，也為基于PXR三維結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計與研發(fā)奠定了堅實基礎(chǔ)。