周光普，周永順，徐杰，譚君，張凡，高劍峰

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子832000)

無論從哪條通路進(jìn)入，布魯氏菌都會(huì)在體內(nèi)擴(kuò)散，并在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細(xì)胞中建立一個(gè)生存和復(fù)制的生態(tài)位[1]。這種細(xì)菌可以產(chǎn)生全身性感染，也可以在給定的器官中優(yōu)先定位繁殖。布魯氏菌病的臨床特征取決于疾病的階段(急性、亞急性、慢性)所侵染的器官和系統(tǒng)，以及其他相關(guān)的器官和系統(tǒng)。盡管布氏菌病的性質(zhì)千變?nèi)f化，但炎癥仍是布氏菌病的一個(gè)特征，受感染組織通常表現(xiàn)為炎癥浸潤。由于布魯氏菌缺乏明顯的毒力因子，布魯氏菌病的病理表現(xiàn)可能源于炎癥驅(qū)動(dòng)過程[2]。

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)是一種廣泛用于治療腫瘤和嚴(yán)重自身免疫性疾病的細(xì)胞毒性烷基化劑[3]。據(jù)報(bào)道，CP可以降低多種免疫反應(yīng)，被廣泛用于動(dòng)物的免疫抑制模型制作，來研究免疫增強(qiáng)劑的效果和原理[4-6]，或者動(dòng)物相關(guān)疾病模型的制作[7]。用環(huán)磷酰胺腹腔注射昆明小鼠，發(fā)現(xiàn)外周血白細(xì)胞數(shù)量降低，小鼠肝腎功能下降，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低[8]，CP可以誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞凋亡，影響小鼠造血功能，導(dǎo)致小鼠模型中外周血細(xì)胞含量發(fā)生變化[9]?？偠灾?，CP對(duì)機(jī)體的造血和免疫系統(tǒng)有廣泛的抑制作用，并且CP的劑量、給藥方式、時(shí)間和受試動(dòng)物的品系、年齡、性別等因素與抑制的效果密切相關(guān)[10]。

本實(shí)驗(yàn)利用CP的生物學(xué)活性，使受試小鼠處于暫時(shí)性的可恢復(fù)的免疫低下狀態(tài)，之后侵染布魯氏菌M5。研究昆明小鼠在CP的作用下，對(duì)布魯氏菌的相關(guān)炎癥反應(yīng)。為布魯氏菌病發(fā)病機(jī)制的研究提供數(shù)據(jù)和圖片支持，為進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞和布魯氏菌的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

6-8周齡，20±2 g清潔級(jí)雌性昆明小鼠80只，購自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：2009-0006。

布魯氏菌M5疫苗株由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

環(huán)磷酰胺購自sigma公司，TNF-a、IFN-γ、NO 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技公司，BSA顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司，TSA、TSB培養(yǎng)基購自BD醫(yī)療器械公司，F(xiàn)4/80抗體購自ThermoFisher公司。

微量移液器(eppendorf)；恒溫培養(yǎng)箱(DNP- 9162)；生物安全柜(BAKER-SG403AHE)；輪式切片機(jī)(Leica-RM2255)；自動(dòng)組織脫水機(jī)(KD-TS1A)；組織包埋機(jī)(KD-BM)；組織勻漿機(jī)(PB100-SP046)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(ELX-800)；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(XFA6100)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示，雌性昆明小鼠80只適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分成4組。第1組為對(duì)照組(Untreated)腹腔注射相同劑量的生理鹽水，第2組為環(huán)磷酰胺組(CP)每只小鼠連續(xù)7 d腹腔注射40 mg/kg的CP，第3組為布魯氏菌M5組(B.melitensis)在第0 d侵染1×106CFU布魯氏菌M5，第4組環(huán)磷酰胺和布魯氏菌M5結(jié)合組(CP+B.melitensis)，連續(xù)7 d腹腔注射40 mg/kg的CP在第0 d侵染1×106CFU布魯氏菌M5。

圖1 實(shí)驗(yàn)方案Fig.1 Experimental protocols

1.2.2 日常觀察記錄

給藥之日起觀察小鼠臨床癥狀：動(dòng)物死亡數(shù)、健康狀況與毒性狀況、小鼠背毛與皮膚情況、眼睛、循環(huán)系統(tǒng)、自主運(yùn)動(dòng)和行為特點(diǎn)。記錄每日體重與進(jìn)食量，分別在接種布魯氏菌后第3、7和14天每組處死6只小鼠，收集組織、血液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.3 血液分析

收集第一天Untreated和CP組小鼠尾靜脈血液，用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞分析。

1.2.4 布魯氏菌侵染小鼠

將布魯氏菌M5株劃線接種于TSA培養(yǎng)基中，倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，在無菌條件下挑取邊緣整齊、中間隆起、表面光滑的單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中，置于200 r/min恒溫?fù)u床，37 ℃震蕩培養(yǎng)72 h。8000 r/min離心2 min，用麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕簼舛日{(diào)整到5×106CFU/mL。在實(shí)驗(yàn)的第0 天，B.melitensis和CP+ B.melitensis組小鼠每只注射200 μL含活菌數(shù)為1×106CFU。

1.2.5 臟器質(zhì)量

在第3、7和14 天分別對(duì)小鼠進(jìn)行撲殺，每組小鼠在上述3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各撲殺6只。將小鼠尸體浸泡在75%酒精中5 min，然后固定在手術(shù)板上，無菌條件下剪開小鼠腹部，觀察小鼠各組織病理變化情況，收集小鼠胸腺、肝、脾，稱重并計(jì)算臟器相對(duì)質(zhì)量。

臟器相對(duì)質(zhì)量=器官重量(mg)/體重(g)×100%。

1.2.6 組織細(xì)菌計(jì)數(shù)

無菌條件下，將小鼠脾臟、肺臟和肝臟組織轉(zhuǎn)移至15 mL無菌離心管中，加入5 mL無菌PBS，用組織勻漿機(jī)勻漿3 min，用無菌PBS將組織勻漿分別作1∶100和1∶1000稀釋，然后分別用原液、1∶100稀釋液、1∶1000稀釋液各100 μL均勻涂布于TSA培養(yǎng)基中，每個(gè)濃度各接種3塊平板，倒置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,計(jì)算各平板菌落數(shù)量。

克脾菌落數(shù)=平板菌落數(shù)×10n/脾臟重量(g)×100%，n為稀釋倍數(shù)。

1.2.7 組織化學(xué)觀察

在無菌條件下取小鼠脾臟、肝臟和肺臟浸入4%多聚甲醛溶液中，24 h后換液，用于組織切片研究。將固定好的脾、肺和肝臟組織用刀片修成0.5 cm見方的組織塊，自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水、透明和浸蠟。石蠟包埋組織，用切片機(jī)連續(xù)切片，厚度約4 μm。用F4/80抗體免疫組化學(xué)檢測(cè)巨噬細(xì)胞浸潤。

1.2.8 細(xì)胞因子檢測(cè)

采集的小鼠非抗凝血，3000 r/min離心10 min，取上清，然后利用ELISA試劑盒(嚴(yán)格按照操作說明進(jìn)行)測(cè)定TNF-a、NO 和IFN-γ的濃度大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般觀察結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)的第五天，觀察到CP組和CP+B.melitensis組小鼠出現(xiàn)明顯的精神萎靡(驅(qū)趕時(shí)不愿活動(dòng))，反應(yīng)遲鈍，行動(dòng)遲緩，消瘦，嗜睡，而Untreated組和B.melitensis組小鼠沒有明顯的癥狀。在實(shí)驗(yàn)的第2 d，CP+B.melitensis小鼠出現(xiàn)被毛凌亂，精神沉郁，個(gè)別小鼠出現(xiàn)弓頭縮背，行動(dòng)遲緩，呼吸困難現(xiàn)象。從圖2中可以看出，CP注射后小鼠體重開始下降，停藥后體重趨于穩(wěn)定。B.melitensis組小鼠體重沒有明顯增長，在第23 d的時(shí)候，與Untreated組差異顯著(P<0.01)，CP+B.melitensis和CP組小鼠差異極顯著(P<0.001)。

圖2 昆明小鼠在試驗(yàn)中的體重變化Fig.2 Average (per group) body weight recording of the KM mice from day 0 and until day 23

2.2 血液分析

40 mg/kg劑量連續(xù)7 d注射CP后，小鼠外周血血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺處理組小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞總數(shù)和粒細(xì)胞總數(shù)降低均超過50%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.01，P<0.001)(圖3)。

圖3 第8 d血液學(xué)指標(biāo)變化，星號(hào)表示與對(duì)照組相比差異的顯著性Fig.3 Day 8 hematology result，Asterisks represent P-value significance

2.3 臟器相對(duì)質(zhì)量

臟器相對(duì)質(zhì)量見(圖4)。

Untreated組CP組B.melitensis組和CP+B.melitensis組小鼠侵染布魯氏菌M5后，第3、7和14 d無菌分離小鼠脾臟、胸腺、肝臟稱重，計(jì)算相對(duì)質(zhì)量。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)第3 d，CP組受環(huán)磷酰胺影響脾臟指數(shù)顯著低于Untreated組(P<0.05)。第7 d，CP+B.melitensis組脾臟相對(duì)質(zhì)量顯著高于Untreated組(P<0.05)，其總體平均值是Untreated組的2倍而B.melitensis組脾臟相對(duì)質(zhì)量平均值雖高于Untreated組但差異不顯著。在第14 d，CP+B.melitensis組和B.melitensis組脾臟指數(shù)均顯著高于Untreated組(P<0.05)。胸腺指數(shù)受環(huán)磷酰胺影響最為明顯，注射環(huán)磷酰胺小鼠均發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的胸腺萎縮。CP組和CP+B.melitensis組胸腺指數(shù)在第3、7和14 d均低于對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)。B.melitensis組胸腺指數(shù)略低于Untreated組，但差異不顯著。CP+B.melitensis組和B.melitensis組肝臟指數(shù)在第3、7和14 d均高于Untreated組，在第7 d時(shí)CP+B.melitensis組小鼠肝臟指數(shù)與Untreated組差異極顯著(P<0.01)，其余時(shí)間CP+B.melitensis組和B.melitensis組與Untreated組相比差異顯著(P<0.05)。

圖4 布魯氏菌注射后第3、7和14 d臟器與體重的比值Fig.4 Average (per group) viscera/body coefficient recording of the KM mice at days3,days 7 and days 14

2.4 組織細(xì)菌計(jì)數(shù)

布魯氏菌侵染小鼠3、7和14 d后，分離計(jì)數(shù)脾臟、肝臟和肺臟細(xì)菌，結(jié)果如圖5所示。脾臟、肝臟和肺臟內(nèi)，CP+B.melitensis組小鼠的活菌數(shù)在3、7和14 d與B.melitensis組小鼠相比差異極顯著(P<0.001)。

2.5 免疫組織化學(xué)觀察

免疫組織化學(xué)觀察見(圖6)。

用F4/80抗體的組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。在脾臟中(圖6A)，Untreated組結(jié)果顯示了清晰地細(xì)胞間隙和少量的成熟巨噬細(xì)胞(黃色顆粒)。得到的組織學(xué)定量結(jié)果證實(shí)：CP+B.melitensis小鼠(p<0.01)，B.melitensis小鼠(P<0.01)相較于Untreated組，向脾臟遷移的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多(數(shù)據(jù)未展示)。隨著時(shí)間的推移，觀察到在CP+B.melitensis和B.melitensis組織中的巨噬細(xì)胞浸潤越來越多。Untreated組小鼠巨噬細(xì)胞浸潤較少，成分散的狀態(tài)分布在脾臟中，被布魯氏菌侵染的脾臟，巨噬細(xì)胞浸潤呈現(xiàn)聚集的狀態(tài)。在肺臟的組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(圖6B)中，可以明顯觀察到Untreated組和CP組肺臟都能看到相對(duì)完整且均勻的肺泡結(jié)構(gòu)，CP+B.melitensis和B.melitensis組幾乎沒有完整的肺泡結(jié)構(gòu)，這可能是小鼠表現(xiàn)出呼吸困難的主要原因。組織學(xué)定量結(jié)果也顯示出，在第3、7和14 d 巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量CP+B.melitensis組(P<0.05)和B.melitensis組均顯著高于Untreated組。在肝臟中也觀察到了相似的結(jié)果(圖6C)，Untreated組顯示出清晰地細(xì)胞間隙和細(xì)胞形態(tài)。CP+B.melitensis和B.melitensis組在第3、7和14 d隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞間隙越來越不明顯，且與Untreated組相比，巨噬細(xì)胞浸潤有顯著增加(P<0.05)。

圖5 組織細(xì)菌分離結(jié)果Fig.5 Bacterial burden (c.f.u.) in spleen

2.6 細(xì)胞因子檢測(cè)

在第3 d時(shí)，CP 組、B.melitensis組和CP+B.melitensis組IFN-γ的含量相較于Untreated組含量顯著減少(P<0.05)，CP 組TNF-α的含量含量顯著降低(P<0.05)，B.melitensis組和CP+B.melitensis組NO含量相較于Untreated組含量略有升高差異不顯著。

在第7 d時(shí)，CP+B.melitensis組IFN-γ含量顯著高于Untreated組(P<0.01)，B.melitensis組和CP+B.melitensis組TNF-α含量顯著低于Untreated組(P<0.05)，CP+B.melitensis組NO含量顯著高于Untreated組(P<0.01)。

第14 d時(shí)，相較于Untreated組，B.melitensis組和CP+B.melitensis組IFN-γ和NO含量顯著升高(P<0.05)，TNF-α含量均顯著降低組(P<0.05)(表1)。

表1 血清細(xì)胞因子含量變化Tab.1 Change of the cytokine levels in the serum

注：*表示在對(duì)應(yīng)天數(shù)與對(duì)照組相比P值顯著性(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。

3 討論

環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide, CP)是自體免疫性疾病、癌癥、血液和骨髓移植中最常用的藥物。如前所述，CP的免疫抑制的效果與其劑量、給藥方式等因素相關(guān)。因此，本研究首先評(píng)價(jià)了CP對(duì)小鼠免疫活性的影響。免疫器官的相對(duì)質(zhì)量表現(xiàn)免疫器官的發(fā)育狀況，能夠間接反映機(jī)體當(dāng)前的免疫狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)40 mg/kg的CP連續(xù)7 d腹腔注射雌性6-8周齡昆明小鼠，能夠使小鼠體重明顯下降，外周血白細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，胸腺和脾臟質(zhì)量下降。說明CP對(duì)小鼠產(chǎn)生了一定程度的骨髓抑制[11]，并且誘導(dǎo)了脾臟和胸腺細(xì)胞凋亡[12-13]，故而引起了小鼠免疫能力的降低，我們觀察的結(jié)果，與之前的環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫抑制的結(jié)果一致[8, 10, 11]。

我們觀察到，布魯氏菌M5在侵染免疫抑制小鼠過程中，產(chǎn)生了更加明顯的被毛凌亂、弓頭縮背等臨床反應(yīng)，并且在其組織器官中分離出了更多的布魯氏菌(圖5)。說明在CP的作用下，為布魯氏菌在小鼠體內(nèi)的繁殖提供了更加舒適的環(huán)境，對(duì)布魯氏菌的生存產(chǎn)生了極大的影響。這些數(shù)據(jù)在今后的研究中可能是有用的，可以方便了解抗菌素藥物或著疫苗對(duì)布魯氏菌侵染宿主的保護(hù)效果，也可以研究在免疫功能受損情況下的布魯氏菌病的情況。更有意義的是，我們可以從環(huán)磷酰胺處理的動(dòng)物體內(nèi)分離出吞噬細(xì)胞，研究宿主病原體的相互作用，以闡明免疫功能受損時(shí)巨噬細(xì)胞MHC抗原遞呈相關(guān)的白細(xì)胞功能和細(xì)胞因子的特異性[7]。

眾所周知，脾臟在機(jī)體免疫過程中發(fā)揮了巨大作用，布魯氏菌的侵染會(huì)導(dǎo)致脾臟腫大[14]。我們的實(shí)驗(yàn)也觀察到類似的結(jié)果，B.melitensis小鼠脾臟質(zhì)量第7 d時(shí)相較于Untreated小鼠升高了50%，同時(shí)CP+B.melitensis小鼠脾臟質(zhì)量升高了138%(圖4)。我們知道，脾臟腫大主要是由脾臟炎性細(xì)胞浸潤引起的，故而我們推測(cè)CP引起了更加強(qiáng)烈的炎性細(xì)胞浸潤。免疫組化結(jié)果證實(shí)了我們的推測(cè)，在脾臟中我們我們發(fā)現(xiàn)了更多的巨噬細(xì)胞浸潤(圖6A)，這可能是引起CP+B.melitensis小鼠脾臟異常腫大的原因。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)CP小鼠在第7 d脾臟質(zhì)量相較于Unterated小鼠略有上升(圖4)，推測(cè)可能是CP小鼠脾臟髓外代償性造血[15]引起的。而在肝臟和肺臟中也發(fā)現(xiàn)了相似的細(xì)胞浸潤結(jié)果(圖6：B、C)，說明在臟器內(nèi)可能產(chǎn)生了更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，這可能是導(dǎo)致小鼠呼吸困難等臨床癥狀的原因[2]。在CP作用后，炎癥反應(yīng)的加劇和或抑制可能與CP減少免疫抑制因子或調(diào)節(jié)T細(xì)胞的作用相關(guān)[16]。而CP+B.melitensis小鼠臟器內(nèi)有更多的布魯氏菌生存，這種結(jié)果很明顯并不是炎癥反應(yīng)減弱或者免疫細(xì)胞募集減少導(dǎo)致的，更有可能的原因是巨噬細(xì)胞殺滅布魯氏菌能力下降或者引起了不同的細(xì)胞浸潤類型[7]。

巨噬細(xì)胞參與布魯氏菌感染的早期炎癥反應(yīng)和宿主防御[17]。免疫組化結(jié)果顯示(圖6)，CP+B.melitensis小鼠巨噬細(xì)胞招募增加，提示巨噬細(xì)胞大量浸潤可補(bǔ)償感染早期免疫細(xì)胞的減少。巨噬細(xì)胞大量浸潤可能導(dǎo)致CP+B.melitensis小鼠感染后血清中促炎因子IFN-γ升高(表1)。IFN-γ調(diào)節(jié)免疫，能夠提高巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬活性，還能夠激活T、B 淋巴細(xì)胞，從而提高機(jī)體的免疫應(yīng)答能力[18]。而TNF-α抑制有利于布魯氏菌在宿主細(xì)胞的生存繁殖，對(duì) TNF-α的分泌抑制是布魯氏菌重要的生存策略[19]。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，并且CP對(duì)TNF-α抑制過程沒有明顯的作用。NO具有抑菌、抗病毒和抗腫瘤的特性，增加NO產(chǎn)量也能增強(qiáng)局部宿主防御機(jī)制，產(chǎn)生過量時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性[20]。CP+B.melitensis小鼠在CP的作用下，產(chǎn)生了更多的NO細(xì)胞因子，B.melitensis小鼠免疫能力相對(duì)健全，可以在布魯氏菌侵染過程中調(diào)節(jié)自身的免疫平衡。在胸腺中，NO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可能在T細(xì)胞的選擇和發(fā)育中發(fā)揮效應(yīng)分子的作用[21]，有趣的是，我們?cè)贐.melitensis小鼠中發(fā)現(xiàn)了胸腺萎縮(圖4)，說明在B.melitensis小鼠中NO對(duì)胸腺可能產(chǎn)生了細(xì)胞毒性?？偠灾?，CP+B.melitensis小鼠產(chǎn)生了更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，但是其具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文是首次報(bào)道CP對(duì)布魯氏菌感染小鼠的過程的影響。描述了CP誘導(dǎo)的小鼠免疫抑制，可能為布魯氏菌的侵染過程提供新的見解。研究布魯氏菌的毒力機(jī)制和宿主間的相互作用，對(duì)于制定更好的公共防疫和新的疫苗與藥物具有重大意義。