黃迪海 ，郭 卉 ，仉 偉 ，秦春芝 ，盛曉丹 ，徐懷英 ，劉 霞 ，張 偉 ，秦卓明 ，

（1. 山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，山東濟南 250100；2. 濟南市動物生物藥品工程技術(shù)研究中心，山東濟南 250100；3. 濟南市動物園管理處，山東濟南 250031；4. 山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，山東濟南 250021；5. 山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟南 250100）

布魯氏菌?。╞rucellosis）是一種人獸共患病，由布魯氏菌屬細菌侵入機體引起。其臨床發(fā)病特點為長期發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等，且可引起人和動物的生殖系統(tǒng)疾病。該病盡管死亡率不高，但可導(dǎo)致人的不孕不育、關(guān)節(jié)炎等復(fù)雜病癥，公共衛(wèi)生意義巨大。由于布魯氏菌為胞內(nèi)寄生，敏感抗生素難以進入細胞發(fā)揮治療作用，因此一旦發(fā)生布魯氏菌感染，很難治愈，易造成極其嚴重的不良后果。目前，對于該病的防控主要依靠疫苗預(yù)防和監(jiān)測凈化。

犬是多種布魯氏菌（豬、牛、羊、犬種）的易感動物。隨著犬和人類關(guān)系的日益密切，布魯氏菌由犬傳播給人和家畜的風險逐漸升高。目前，我國人畜間布魯菌病已波及28個?。ㄖ陛犑?、自治區(qū)），2017年發(fā)病人數(shù)高達38 554例。王濤等[1]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新疆烏魯木齊市牧區(qū)犬布魯氏菌病總流行率高達41.5%。為客觀評價山東省濟南市犬布魯氏菌病流行情況，2016—2017年，對濟南市部分轄區(qū)的寵物犬和犬場飼養(yǎng)犬采樣進行布魯氏菌分離和抗體檢測。

1 材料

1.1 犬血清樣品

2016—2017年，在濟南市歷下區(qū)、市中區(qū)、歷城區(qū)、天橋區(qū)寵物醫(yī)院以及槐蔭區(qū)某種犬場，采集犬血清502份（表1），涉及品種包括雪納瑞、狼青、西施、泰迪、金毛、比熊、博美、京巴、吉娃娃、拉布拉多、斗牛、牧羊、阿拉斯加以及田園犬、雜交犬等25個品種。犬靜脈采集全血，凝固，4 000 r/min離心10 min，收集上清（清亮、無溶血），4 ℃保存。

表1 濟南市犬血清采集情況統(tǒng)計

1.2 病料

選擇發(fā)生過流產(chǎn)的布魯氏菌血清學陽性雌犬3只，每只犬后肢靜脈采集抗凝血1份。冷藏條件下，于采樣當天送至中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，委托其檢測。

1.3 檢測試劑

動物布魯氏菌病競爭ELISA（cELISA）抗體檢測試劑盒：抗原為光滑型布魯氏菌，用于檢測豬、牛、羊種布魯氏菌抗體；布魯氏菌虎紅平板凝集試驗抗原（犬種）：抗原為粗糙型布魯氏菌；布魯氏菌的標準陰性和陽性血清：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所丁家波研究員惠贈。

2 方法

2.1 cELISA抗體檢測

2.1.1 加樣 取抗原包被板，以1×洗滌液300 μL/孔洗板1次，棄洗滌液；將1:20稀釋的待檢血清以及陽性和陰性對照血清分別加入ELISA板，50 μL/孔，其中陽性對照和陰性血清各加2孔；加樣結(jié)束后，加入1:50稀釋的單抗，50 μL/孔，振蕩混勻5 min，37 ℃作用30 min后取出反應(yīng)板，棄反應(yīng)液；每孔加1×洗滌液300 μL，洗滌3次后甩干。

2.1.2 加酶標抗體 將羊抗鼠酶標抗體，用抗體稀釋液作1:100稀釋后，每孔加入100 μL，37 ℃作用30 min，按2.1.1的方法洗滌3次，甩干。

2.1.3 顯色與終止 將底物溶液A和B按1:1（V/V）混合后，立即加入ELISA板中，100 μL/孔，室溫避光顯色15 min后，每孔加50 μL終止液終止反應(yīng)；15 min內(nèi)用酶標儀測定OD450nm值。

2.1.4 結(jié)果判定

2.1.4.1 計算公式 抑制率（PI）=（陰性對照OD450nm－樣品OD450nm）/陰性對照OD450nm×100%

2.1.4.2 試驗成立條件 2個陰性對照血清重復(fù)測定孔的平均OD450nm≥2.0，2個陽性對照血清重復(fù)測定孔的平均OD450nm＜0.2，且PI平均值≥90%，試驗成立。

2.1.4.3 結(jié)果判定 血清樣本PI≥30%，為布魯氏菌抗體陽性；血清樣本PI＜30%，為布魯氏菌抗體陰性。

2.2 虎紅平板凝集試驗（RBPT）

取犬血清和抗原各25 μL，按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646—2002）方法操作。在陰性、陽性血清對照成立的條件下，對被檢血清進行判定。受檢血清在4 min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者，判為陽性；無凝集現(xiàn)象，且呈均勻粉紅色者，判為陰性。

2.3 病原分離鑒定

按Betsy等[2]的方法進行犬布魯氏菌培養(yǎng)，挑取單菌落進行PCR鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 競爭ELISA

在502份犬血清樣品中，檢出光滑型布魯氏菌抗體陽性44份。其中，歷下區(qū)陽性率最高（13.24%），其次是歷城區(qū)（4.03%）和天橋區(qū)（3.53%），市中區(qū)和槐蔭區(qū)最低，未發(fā)現(xiàn)感染。在光滑型布魯氏菌抗體陽性犬中，雌犬占比偏高，為61.36%。在陽性檢測結(jié)果中，強陽性17份，占比38.64%（表2）。

表2 犬血清光滑型布魯氏菌抗體檢測結(jié)果

3.2 虎紅平板凝集試驗

在502份犬血清樣品中，檢出粗糙型布魯氏菌抗體陽性10份，抗體陽性率為1.99%。其中，槐蔭區(qū)犬場陽性率最高（100%）。在陽性樣品中，雌犬和雄犬占比均衡（表3）。

表3 犬血清粗糙型布魯氏菌（犬種）抗體檢測結(jié)果

3.3 病原分離鑒定

對發(fā)生過流產(chǎn)的布魯氏菌血清學陽性雌犬采集的3份血液樣品，在中國獸藥監(jiān)察所進行病原分離鑒定，結(jié)果分離到2株犬種布魯氏菌，經(jīng)PCR檢測，在272 bp處擴增出預(yù)期的IS711片段（圖1）。

4 討論

4.1 檢測方法

布魯氏菌分離是布魯氏菌病診斷的“金標準”。但PCR方法不失為一種快速、便捷的核酸快速診斷技術(shù)，可有效規(guī)避繁瑣的病原生化實驗鑒定，而只需對布魯氏菌的關(guān)鍵基因，如16S～23S rRNA基因、IS711插入序列和bcsp31基因等鑒定即可。該方法已成為國家標準。此外，PCR對于死亡的病菌仍可檢出，這增加了病原確診的概率。血清學檢測是發(fā)現(xiàn)布魯氏菌感染的主要手段，安全性和特異性高，敏感性強。其中，最為快速的定性診斷方法是虎紅平板凝集試驗和膠體金試紙條檢測。這兩種方法常用于不同種型布魯氏菌的初篩。cELISA方法特異性強，靈敏度和準確度高，適用于不同種型布魯氏菌的大規(guī)模監(jiān)測和確診；SAT（試管凝集試驗）、CFT（補體結(jié)合試驗）常用于豬、牛、羊種布魯氏菌的確診，但操作較為繁瑣。

需要強調(diào)的是，鑒于布魯氏菌活菌存在嚴重的公共衛(wèi)生威脅，因此不建議在缺乏生物安全的環(huán)境下進行病原分離。病原的分離和鑒定應(yīng)到專業(yè)的、具有資質(zhì)和高生物安全級別的實驗室進行，以防止檢測人員的意外感染。

圖1 犬種布魯氏菌PCR檢測結(jié)果

4.2 流行病學

本調(diào)查分離到2株犬種布魯氏菌，說明濟南市犬中存在犬種布魯氏菌流行。研究表明，全國其他地區(qū)也存在犬種布魯氏菌流行。王寧等[3]、周桂蘭等[4]、張賀等[5]分別從北京市寵物犬中分離出4株、1株、1株犬種布魯氏菌。近十年來，四川省[6]、湖南省[7]、內(nèi)蒙古（錫盟地區(qū)）[8]、北京市[3，9]、上海市[10]、新疆（烏魯木齊市）[1]均開展了犬布魯氏菌病區(qū)域調(diào)查，發(fā)現(xiàn)犬血清抗體陽性率為0.91%～25.5%。其中：四川省陽性率最低，SAT陽性率為0.91%，RBPT陽性率為10.91%；烏魯木齊市最高，間接ELISA總體陽性率為25.5%（牧區(qū)陽性率高達41.5%）。

本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，濟南市犬中流行的布魯氏菌以光滑型為主。光滑型布魯氏菌可感染牛、羊、豬等家畜，也可感染人，具有較大的公共衛(wèi)生威脅。隨著寵物犬飼養(yǎng)數(shù)量以及人犬密切接觸概率的增大，這種潛在危險會逐漸加大，應(yīng)引起高度重視。類似的犬感染光滑型布魯氏菌的情況在國內(nèi)多有發(fā)生，如2010—2018年，國內(nèi)有9個城市先后報道了犬布魯氏菌病散發(fā)病例，大連市13例[11]，新鄉(xiāng)市8例[12]，婁底市3例[13]，開封市11例[14]，東莞市[15]、淮安市[16]、丹東市[17]、撫順市[18]、烏魯木齊市[19]各1例，多個病例的發(fā)生與飼喂羊下腳料有關(guān)。

雖然本次調(diào)查的光滑型布魯氏菌抗體陽性率較高，但未分離到光滑型布魯氏菌，其原因可能與本次采樣數(shù)量偏少有關(guān)；槐蔭區(qū)犬場的虎紅平板凝集試驗粗糙型布魯氏菌抗體陽性率最高，為100%，其原因可能也與樣本較少有關(guān)（3只），且其中1只雌犬3月前曾發(fā)生過流產(chǎn)，為定向采樣。后續(xù)需要加大采樣量，開展系統(tǒng)的流行病學調(diào)查和病原分離鑒定，進一步掌握本地犬布魯氏菌病的真實流行情況。

4.3 防控策略

布魯氏菌病是我國的人乙類傳染病、二類動物疫病，是我國嚴格控制和凈化的病種。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，犬在家畜和人的布魯氏菌病流行中扮演重要角色，因此需要做好犬的布魯氏菌病防控，如加強犬布魯氏菌病科普知識宣傳，限制犬的自由活動范圍，減少犬與羊、牛、豬的接觸，不給犬飼喂生的羊肉、牛肉、豬肉及副產(chǎn)品，定期進行布魯氏菌血清學檢測和犬舍消毒。此外，養(yǎng)犬人應(yīng)做好個人衛(wèi)生防護，接觸犬后，應(yīng)及時洗手。一旦發(fā)現(xiàn)犬患有長期發(fā)熱、流產(chǎn)、附睪炎、睪丸炎等布魯氏菌病癥狀，應(yīng)立即隔離，然后委托專業(yè)實驗室進行布魯氏菌血清學和病原學確診。如果確診感染光滑型布魯氏菌，就盡快將犬實行安樂死并作無害化處理。對感染粗糙型布魯氏菌的犬，可選用斯帕沙星、米諾環(huán)素、利福平、多西環(huán)素、鏈霉素、阿莫西林/克拉維酸鉀、左氧氟沙星等敏感藥物[20]配伍使用，隔離治療3～8周，治愈后對其進行絕育。與病犬密切接觸的人員可到省、市級疫控中心采血檢測，并采取相應(yīng)的防范措施。

5 結(jié)論

本次調(diào)查在山東省濟南市5個轄區(qū)采集502份犬血樣，利用競爭ELISA和虎紅平板凝集試驗，進行光滑型、粗糙型布魯氏菌抗體檢測，發(fā)現(xiàn)抗體陽性率分別為8.76%、1.99%，表明濟南市寵物犬中的光滑型布魯氏菌感染率較高，因而布魯氏菌通過犬傳播給家畜和人的潛在風險較高，需做好犬布魯氏菌病的綜合防控。