黃宇，馮健，胡昌江，李文兵

1.四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，四川 成都 611900；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥配方顆粒質(zhì)量與臨床療效評(píng)價(jià)重點(diǎn)研究室，四川 成都 611900；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

槐花為豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花及花蕾，槐花、炒槐花和槐花炭為《中華人民共和國(guó)藥典》歷版均收載的其3種飲片[1]?；被橹嗅t(yī)臨床常用的止血藥，具有清肝瀉火、清熱涼血的功效；炒槐花的清熱涼血作用弱于槐花，止血作用遜于槐花炭而強(qiáng)于槐花，用于脾胃虛寒的出血患者[2]?；被ㄖ饕J丁、槲皮素、異鼠李素等黃酮類(lèi)成分以及鞣質(zhì)，此外還含有皂苷類(lèi)、甾類(lèi)等多種成分[3-4]。炒槐花配方顆粒由槐花經(jīng)過(guò)炮制處理，應(yīng)用現(xiàn)代制藥工藝提取、濃縮、干燥制粒而成。目前，炒槐花配方顆粒的研究未見(jiàn)報(bào)道，僅有炒槐花、槐花飲片含量測(cè)定、指紋圖譜等研究[5-7]，本文建立其特征峰指紋圖譜，可以系統(tǒng)地反映炒槐花配方顆粒水溶性化學(xué)成分的全貌。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫1200型高效液相色譜儀(G1312B型二元泵、G1315C型DAD檢測(cè)器)；電子天平BP-211D(Sautoris，德國(guó))；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)等。

1.2 試藥

蘆丁對(duì)照品、槲皮素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：100080-201409、100081-201610)；甲醇(迪馬公司，色譜純)；水為重蒸水；其他試劑均為分析純。

炒槐花配方顆粒(四川新綠色藥業(yè)，批號(hào)分別為：101001、100102、120301、0908146、0904176、1111015、A111075、A100617、A081883)編號(hào)為S1～S9。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇為流動(dòng)相A，以1%冰醋酸溶液為B，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為257 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

取槲皮素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品約0.1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲(功率：250 W，頻率：50 kHz)處理30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取炒槐花配方顆粒(批號(hào)：1111015，下同)精密稱(chēng)定，按照2.2.2的制備方法制備。將制備的供試品溶液，按2.1色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，4個(gè)特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.00%～0.02%；特征峰的相對(duì)峰面積RSD為0.00%～0.77%，表明該儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取炒槐花配方顆粒6份，分別按照2.2.2的制備方法制備。取供試品溶液，按2.1色譜條件測(cè)定，所得各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值分別為0.00%～0.09%；特征峰的相對(duì)峰面積RSD值為0.00%～0.94%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取同一份炒槐花配方顆粒供試品溶液，按2.1色譜條件，分別于0、2、6、12、24 h測(cè)定。結(jié)果分析，各特征色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積變化較小，其RSD值分別為0.00%、1.10%、0.33%、0.12%和0.00%、1.90%、1.52%、1.91%，均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 炒槐花配方顆粒特征圖譜的建立 按照2.2樣品制備方法和2.1色譜條件，分別對(duì)9批炒槐花配方顆粒進(jìn)行測(cè)定，記錄70 min的色譜圖。根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定及各批次樣品均能檢出且峰相對(duì)較高的原則，共選擇了4個(gè)重復(fù)性較好的峰作為特征峰。結(jié)果見(jiàn)表2～3，圖1～2。結(jié)合現(xiàn)代研究表明，蘆丁為槐花的主要有效成分，故以蘆丁峰(峰1)為參照峰。4個(gè)共有峰的平均相對(duì)保留時(shí)間依次為：1.000、1.197、1.234、1.439，RSD均低于0.1%，具有較好的重復(fù)性，可作為炒槐花配方顆粒的特征峰。

表2 9批炒槐花配方顆粒相對(duì)保留時(shí)間

表3 9批炒槐花配方顆粒相對(duì)峰面積比值

圖1 炒槐花配方顆粒HPLC指紋圖譜共有模式

圖2 9批次炒槐花配方顆粒HPLC指紋圖譜

2.4.2 炒槐花配方顆粒特征圖譜相似度評(píng)價(jià) 將所得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)指定的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”，設(shè)定參照?qǐng)D譜，將9批次樣品中4個(gè)共有特征峰自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜R，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表4。9批樣品的相似度均大于0.9，說(shuō)明9批炒槐花配方顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定。

3 討論

筆者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別考察了提取溶媒甲醇、70%甲醇、50%甲醇，其中甲醇作為提取溶媒色譜峰最佳，綜合考慮，確認(rèn)甲醇作為提取溶媒。在提取時(shí)間上，分別考察了超聲提取時(shí)間15、30、45 min，結(jié)果表明30 min時(shí)，炒槐花配方顆粒中主要成分提取充分，故確定提取時(shí)間為30 min。

為保證炒槐花配方顆粒的質(zhì)量一致性[8-9]，筆者對(duì)炒槐花炒制工藝進(jìn)行研究，以蘆丁含量和炒制顏色情況為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察了炒制時(shí)間、炒制溫度對(duì)炒槐花的影響。蘆丁含量測(cè)定的色譜條件和供試品制備方法均參考《中華人民共和國(guó)藥典》2015版“槐花”項(xiàng)下檢測(cè)方法。參考各地飲片炮制規(guī)范以及2015版《中華人民共和國(guó)藥典》“炒槐花”項(xiàng)下炮制要求，最終確定，炒槐花的炮制方法為：取槐花飲片投入炒制容器內(nèi)中，90 ℃下清炒4～8 min，至表面深黃色時(shí)，取出，放涼。

本實(shí)驗(yàn)建立了炒槐花配方顆粒的高效液相指紋圖譜，系統(tǒng)地反映了其水提物化學(xué)成分的全貌，該圖譜方法的建立，可作為炒槐花的質(zhì)量控制方法。通過(guò)對(duì)炒槐花配方顆粒的分析，共建立4個(gè)共有峰，其中指認(rèn)2個(gè)峰分別為蘆丁、槲皮素。最終以蘆丁特征峰作為參照峰(S峰)，計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為1.000(峰1，S峰)、1.197(峰2)、1.234(峰3)、1.439(峰4)。結(jié)合峰2、峰3的紫外吸收光譜圖，初步判斷峰2、峰3均為黃酮類(lèi)成分，后期將繼續(xù)開(kāi)展其成分確認(rèn)研究。

表4 9批次炒槐花配方顆粒HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

采用本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相指紋圖譜方法，分別對(duì)槐花配方顆粒和炒槐花配方顆粒進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在3.8 min左右炒槐花配方顆粒較槐花配方顆粒多出1個(gè)峰，該峰的最大吸收波長(zhǎng)為286 nm，充分說(shuō)明槐花在炮制前后成分發(fā)生了變化，該峰亦可用于兩者的鑒別。