陳彥旭，周坤，范麗瑋，韓冰毓，陳洛暉，唐志豪，向秋玲

中山大學(xué) 中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510080

附子是毛茛科烏頭屬植物烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品。主產(chǎn)于四川、湖北、湖南等地。它是中藥中“回陽救逆第一品”，屬溫里藥，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效[1]，可治療陰盛格陽，用于一切沉寒痼冷之疾。但附子目前臨床應(yīng)用存在的主要問題是具有毒性。附子中含有的烏頭類生物堿，包括烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿等，是烏頭類有毒中藥的藥效成分，同時也是毒性成分[2]。通過加熱[3]、配伍甘草人參、生姜[4-6]等中藥材炮制附子的方法，雖然可以顯著降低附子的藥毒性，但其安全范圍仍然很窄[7]，加之個體耐受程度不同，進(jìn)一步限制了附子在臨床上的用途。相關(guān)研究報(bào)道，附子可引起多個系統(tǒng)癥狀，以心血管系統(tǒng)癥狀尤為突出，常表現(xiàn)為多種類型的心律失常重疊或交替出現(xiàn)[8-9]。其心肌毒性還可以導(dǎo)致膜通透性增高，心肌細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶同工酶(lactate dehydrogenase isoenzyme，LDH1)外漏，心肌細(xì)胞水腫[10]。因此附子的減毒方法及毒性機(jī)制的研究已經(jīng)成為研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來許多學(xué)者運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)對附子的減毒方法及毒性作用的機(jī)制進(jìn)行了研究，主要從配伍后藥效學(xué)改變、化學(xué)成分變化等方面進(jìn)行。本課題組試圖通過改變藥代動力學(xué)的方式探索一種新的減輕附子毒性的方法，為中醫(yī)臨床使用附子時提供拓寬其安全范圍的新途徑。已有研究顯示烏頭堿類主要通過肝藥酶CYP3A4/5、CYP2D6[11]代謝后排出，本研究擬在此基礎(chǔ)上選取利福平作為肝藥酶誘導(dǎo)劑，通過比較小鼠單獨(dú)給予生附片與不同劑量的利福平誘導(dǎo)后再給予生附片的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過心電圖、LDH1、心臟病理切片等指標(biāo)，明確肝藥酶誘導(dǎo)劑對生附片毒性的保護(hù)影響，探討CYP450在生附片毒性表現(xiàn)過程中的作用。

1 材料

1.1 動物

昆明鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量(25±5)g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SYXK(粵)2017-0081。常溫常濕，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為5組，每組10只：對照組(Control)，生附片組(Model)，生附片+利福平低劑量組(RFP-L，90 mg·kg-1)，生附片+利福平中劑量組(RFP-M，120 mg·kg-1)，生附片+利福平高劑量組(RFP-H，150 mg·kg-1)。

1.2 儀器

BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(四川省成都泰盟科技有限公司)；乳酸脫氫酶同工酶(LDH1)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SC-02離心機(jī)(安徽中佳科學(xué)儀器有限公司)；紫外分光光度儀(上海元析儀器有限公司)。

1.3 藥物

生附片(產(chǎn)地為四川江油)購于廣州同仁堂藥店，經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科莫穗林主任醫(yī)師鑒定為烏頭AconitumcarmichaeliiDebx.的子根的加工品。利福平(浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號：H33020235)購于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院。

2 方法

2.1 動物分組給藥與實(shí)驗(yàn)操作

按照文獻(xiàn)報(bào)道[4]，取生附片加入8倍劑量蒸餾水浸泡5 h，煮沸后加熱提取30 min，過濾得到第一次濾液；過濾物再次加6倍量蒸餾水，煮沸后加熱提取30 min，再次過濾得到濾液；合并兩次濾液，70 ℃濃縮至足夠質(zhì)量濃度后經(jīng)計(jì)算定量稀釋至3.3 g·mL-1。取450 mg利福平溶于37.5 mL蒸餾水制成溶液。實(shí)驗(yàn)前所有小鼠禁食不禁水8 h，利福平低、中、高劑量組(RFP-L、RFP-M、RFP-H)分別用不同質(zhì)量濃度利福平溶液灌胃。4 h后生附片組(Model)和利福平低、中、高劑量組分別用生附片提取液(按照55 g·kg-1)灌胃。對照組給予等量蒸餾水灌胃。于灌胃1 h后將小鼠仰位固定于木板，連接已預(yù)熱的心電圖電極(II導(dǎo)聯(lián))，用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)持續(xù)監(jiān)測1 h并記錄原始心電圖數(shù)據(jù)。完成記錄心電圖后眼眶取血，用脊椎脫臼法處死小鼠，立即取心臟于固定液中浸泡備用。

2.2 心電圖分析

從BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)持續(xù)記錄的1 h心電圖數(shù)據(jù)中，由BL420系統(tǒng)自動統(tǒng)計(jì)各組記錄的1 h區(qū)間內(nèi)的平均心率。從每只小鼠的心電圖中隨機(jī)截取10段時長1 min的圖像，在截取的心電圖中識別并標(biāo)記每一個PR間期、P波、QRS波群，并由BL420系統(tǒng)自動記錄并統(tǒng)計(jì)各自時限，得到對應(yīng)的均值與標(biāo)準(zhǔn)差。觀察并計(jì)數(shù)10段心電圖數(shù)據(jù)中房室傳導(dǎo)阻滯以及T波高聳的病理性波段出現(xiàn)的頻次，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定每只小鼠異常心電出現(xiàn)頻次，≥10次則記錄為病理性心電異常陽性。

2.3 LDH1酶活性測定

LDH1活性采用酶分析法測定。小鼠眼眶取血后室溫靜置1 h，5000 r·min-1離心10 min。離心后將上清液吸出，分裝備用。取24 μL雙蒸水，向其中加入800 μL試劑1，混勻后37 ℃孵育3 min，加入200 μL試劑2，混勻后37 ℃孵育2 min，用UV-5200型紫外可見分光光度計(jì)在340 nm波長檢測吸光度，按LDH1試劑盒說明書上的公式計(jì)算LDH1活力。

2.4 組織病理切片分析

取小鼠心臟組織放入甲醛溶液中固定，乙醇脫水，石蠟包埋后切片，切片厚約5 μm，每個標(biāo)本各切3片，脫蠟、二甲苯透明，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)常規(guī)染色，光鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。按Rezkalla1的方法計(jì)算心肌病理組織學(xué)積分1[12]，即每張切片隨機(jī)取5個高倍視野，計(jì)算每個視野中炎性細(xì)胞浸潤及壞死區(qū)域面積與整個視野心肌切片面積之比：無明顯病變計(jì)0分；病變面積<25%，計(jì)1分；病變面積25%～50%，計(jì)2分；病變面積51%～75%，計(jì)3分；病變面積>75%，計(jì)4分。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 利福平誘導(dǎo)減少生附片引起的心律失常

小鼠心電圖變化如圖1所示。圖1A為小鼠正常心電圖，可見P波規(guī)律出現(xiàn)，PR間期恒定，QRS寬度恒定。圖1B為二度房室傳導(dǎo)阻滯，竇性心律，PR間期恒定，P波未見異常，每隔數(shù)個心動周期出現(xiàn)正常P波后無QRS波群。圖1C可見竇性心律，PR間期恒定，P波后QRS波群規(guī)律出現(xiàn)，QRS波群與T波分界不清，T波高尖明顯，部分心動周期ST段呈上斜型表現(xiàn)，提示發(fā)生心肌缺血。對照組PR間期(0.037±0.011)s，P波時間(0.017 5±0.035 0)s，QRS波群時限(0.027 5± 0.012 5)s，心率平均為514次/min。與對照組相比，生附片組小鼠出現(xiàn)心動過速，平均心率達(dá)到738次/min；同時可見多處二度房室傳導(dǎo)阻滯及T波高聳心電圖改變。而在加入不同質(zhì)量濃度的利福平后，小鼠的心電圖均發(fā)生了不同程度的改善。隨著利福平質(zhì)量濃度的提高，利福平低劑量組、利福平中劑量組、利福平高劑量組的小鼠相比附子組房室傳導(dǎo)阻滯發(fā)生率分別下降20%、40%、60%，T波高聳發(fā)生率分別下降12.5%、25%、50%，結(jié)果和生附片組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)；心率分別下降8.6%、17%、17.1%，結(jié)果和生附片組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)；提示利福平誘導(dǎo)可改善附子引起的心律失常。

注：A.小鼠正常心電圖；B.二度房室傳導(dǎo)阻滯；C.T波高聳。圖1 小鼠心電圖變化

表1 不同質(zhì)量濃度利福平對附子致小鼠異常心電發(fā)生的影響

注：與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

注：與Model組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；下同。圖2 不同質(zhì)量濃度利福平對附子致小鼠心動過速的影響

3.2 利福平抑制附子損傷心肌引起的血清LDH1活力升高。

當(dāng)心肌受到損傷時LDH1可釋放到血清中，其活性可反映出心肌損傷程度。如圖3所示，生附片組LDH1活性為(817.4±104.5)U·L-1，較對照組(32.14±12.64)U·L-1顯著升高。而預(yù)先使用低、中、高劑量利福平誘導(dǎo)組酶活性分別下降了71.54%、78.73%、86.01%，與生附片組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示利福平誘導(dǎo)可降低血清中LDH1酶活性，且具有劑量依賴性。

圖3 不同質(zhì)量濃度利福平含藥血清對附子致LDH1釋放的影響

3.3 利福平改善附子引起的心肌組織損傷

對照組心肌纖維排列規(guī)則，心肌細(xì)胞形態(tài)正常；模型組心肌細(xì)胞液化性壞死，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡及空泡融合，肌原纖維和細(xì)胞器廣泛溶解消失，細(xì)胞呈空鞘狀；RFP-L組心肌損傷有所改善，視野內(nèi)僅見局部因缺血而呈波浪狀變形，病變心肌纖維變細(xì)；RFP-M組心肌波浪狀變形區(qū)域減?。籖FP-H組心肌幾無病理改變。與對照組相比，其他各組病理積分有不同程度的升高。病理評分均值：附子組>低劑量利福平組>中劑量利福平組>高劑量利福平組>清水組(見圖4)。評分病理圖片見圖5所示。運(yùn)用方差分析顯示：生附片組與對照組相比，病理積分明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高、中、低劑量利福平組較附子組而言病理積分均值下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。附子組模型建立成功，利福平灌胃能降低附子造成的心肌病理改變，且隨利福平劑量增大心肌病理改變越明顯。

圖4 不同質(zhì)量濃度利福平對附子致小鼠心臟組織病理評分的影響

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)加用不同質(zhì)量濃度的利福平可以減少附子誘導(dǎo)的心肌毒性作用，包括附子引起的心電圖異常(心動過速、房室傳導(dǎo)阻滯和心肌缺血)[13-15]，心肌損傷(血清心肌酶活力增高和心肌組織病理積分增高)。利福平不同質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果顯示毒性作用減輕水平與利福平不同質(zhì)量濃度存在正相關(guān)，表明利福平作為肝藥酶誘導(dǎo)劑可以顯著減輕附子的急性毒性，并且存在顯著的劑量依賴性。

與對照組小鼠心電圖相比，生附片組小鼠出現(xiàn)心動過速與心律失常。烏頭堿是附子引起心律失常的物質(zhì)之一，其心臟毒性主要機(jī)制是通過興奮延髓的迷走神經(jīng)中樞節(jié)后纖維釋放大量乙酰膽堿，引起心肌細(xì)胞膜鉀離子通道通透性增加，鉀離子外流增多，第四期自動除極化速度減慢，導(dǎo)致竇房結(jié)自律性下降。除竇房結(jié)外，房室結(jié)的功能也受到抑制，其他部位異位起搏點(diǎn)節(jié)律相對增強(qiáng)，從而產(chǎn)生房室傳導(dǎo)阻滯與逸搏，生附片組與3個實(shí)驗(yàn)組中均可見典型的房室傳導(dǎo)阻滯，但發(fā)生的頻率有顯著差異。此外，附子也可以使心肌細(xì)胞動作電位時程(APD)延長，增強(qiáng)細(xì)胞膜鈉電流[16]，增強(qiáng)心室肌內(nèi)向整流鉀電流、L型鈣離子電流，抑制瞬時外向鉀電流，易引起折返沖動[17]以及房性早搏、房性心動過速、心房顫動等多種類型的心律失常。當(dāng)心室內(nèi)異位起搏點(diǎn)興奮性增加[18]，可導(dǎo)致室性心動過速、室顫等，但這部分類型的心律失常在本次實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)不明顯。

注：圖A、B、C、D依次記為0分、1分、2分與3分，其中紅色箭頭為心肌細(xì)胞胞漿空泡變性和肌原纖維溶解，藍(lán)色箭頭可見擴(kuò)張血管周圍心肌間質(zhì)浸潤的炎細(xì)胞。圖5 利福平對小鼠心臟組織形態(tài)學(xué)的影響(×100)

LDH能催化丙酮酸的氧化轉(zhuǎn)化為乳酸，常被用作炎癥標(biāo)記物。它存在于幾乎所有組織的細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞損傷后從細(xì)胞中釋放出來，因此血清中的LDH濃度反映了細(xì)胞膜通透性增高程度?？梢杂糜诒O(jiān)測細(xì)胞和組織損傷。而LDH1亞型主要存在于心肌組織中，因此血清中LDH1酶活性反映了心肌組織損害程度。在本實(shí)驗(yàn)中，小鼠血清中LDH1值隨利福平劑量增加而減少，體現(xiàn)小鼠心肌細(xì)胞損傷減輕；組織切片病理評分亦隨之下降，也佐證了這一點(diǎn)。

為了實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步臨床應(yīng)用上的推廣還需要解決幾個問題：一是利福平對附子急性毒性的緩解作用存在劑量依賴性，但目前的實(shí)驗(yàn)尚未確定其是否存在最佳效應(yīng)濃度，加之利福平本身具有一定的肝毒性，所以臨床應(yīng)用時的用量規(guī)范亟需進(jìn)一步探究與測試。二是選取的昆明鼠構(gòu)建附子心臟毒性的病理模型存在一定的局限性，臨床上在人體內(nèi)用藥的探究應(yīng)選用更加多元化的指標(biāo)，更多的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行評估分析才能進(jìn)一步得到成熟的結(jié)論作為該用藥方式推廣的依據(jù)。三是我們對于慢性毒性的認(rèn)識仍需要更進(jìn)一步的探究。

綜上所述，利福平作為肝藥酶誘導(dǎo)劑可以顯著減輕附子的急性毒性，并且存在顯著的劑量依賴性，但短時間內(nèi)無法扭轉(zhuǎn)附子造成的急性損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論為臨床附子減毒提供了一個新的思路與理論數(shù)據(jù)參考，將促進(jìn)附子的臨床應(yīng)用安全范圍擴(kuò)大。當(dāng)然這也只是初步的探究，雖然應(yīng)用于臨床尚待進(jìn)一步的研究，但這方面的實(shí)際效益展望良好，將對附子在中醫(yī)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。