齊琪，王彥，莫雨佳，羅菊元，喻祥龍，陸洋，杜守穎

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

羧酸酯酶(Carboxylesterases，CESs)，屬于α/β水解酶超家族成員，是體內(nèi)重要的Ⅰ相藥物代謝酶，在不同種屬動(dòng)物體內(nèi)普遍存在。人體內(nèi)主要為羧酸酯酶1(hCE1)和羧酸酯酶2(hCE2)，這兩者氨基酸序列的同源性為48%，在組織分布、底物特異性等方面存在較大差異[1-2]，hCE1在肝臟中高表達(dá)[3]，hCE2在小腸和結(jié)腸中高表達(dá)[4]。人類與常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在hCE1和hCE2的分布上也存在顯著的種屬差異。羧酸酯酶除參與小分子脂肪酸和膽固醇的運(yùn)輸代謝外[5]，還會(huì)直接影響藥物的首過代謝(腸、肝)，因藥物導(dǎo)致相關(guān)羧酸酯酶的表達(dá)與活性變化是藥-藥相互作用的重要原因之一。如抗癌藥伊立替康和卡培他濱等被設(shè)計(jì)成無活性的酯類前體藥，經(jīng)羧酸酯酶水解后起效，當(dāng)聯(lián)用白花前胡丁素(hCE1強(qiáng)抑制劑)[6]或五味子甲素(hCE2強(qiáng)抑制劑)[7]時(shí)，可使抗癌效果降低。又如抗血栓藥氯吡格雷大部分在肝臟中經(jīng)CESs代謝失活，剩下約15%經(jīng)CYP酶系轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物，CESs代謝能力的變化會(huì)影響氯吡格雷在體內(nèi)的分布代謝，進(jìn)而影響活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和藥效的發(fā)揮[8]。

三七是一種散瘀止血常用中藥，有很好的抗缺血損傷和抗腦缺血再灌注損傷活性[9]，在心腦血管疾病中，常與化學(xué)藥共用。如在阿司匹林與三七總皂苷相關(guān)制劑(血塞通、血栓通等)合用治療腦卒中，兩者聯(lián)用后抗血小板凝集作用強(qiáng)于阿司匹林或三七總皂苷單用[10]。體內(nèi)參與阿司匹林代謝的酯酶統(tǒng)稱為阿司匹林酯酶，它主要作用于酯鍵的羧酸酯水解酶。阿司匹林原型藥物可發(fā)揮藥效作用，被水解為水楊酸后無抗血小板聚集作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可降低阿司匹林的體內(nèi)代謝，這可能是聯(lián)用增效的原因之一。為進(jìn)一步明確三七總皂苷對(duì)阿司匹林的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在體外肝微粒體水平下對(duì)三七總皂苷抑制羧酸酯酶活性的能力進(jìn)行探究，為三七聯(lián)用羧酸酯酶底物提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

熒光素二乙酸酯(FDA)和熒光素(F)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度>97%)，2-(2-苯甲酰基-3-甲氧基苯基)-苯并噻唑(BMBT)和其水解產(chǎn)物(HMBT)(大連化學(xué)物理研究所，純度>98%)，雙(4-硝基苯基)磷酸酯(BNPP)(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，純度>98%)，三七總皂苷原粉(PNS)(云南三七科技有限公司，批號(hào)：110870-201603)，小鼠肝微粒體(MLM)(美國Corning Gentest公司)，二甲基亞砜(DMSO)(北京化工廠，分析純)，乙腈[賽默飛世爾科技(中國)有限公司，色譜純]，磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國Corning公司，1×，pH 7.4)。

1.2 儀器

BS224型電子天平(德國賽多利斯公司)，微量移液器(德國艾本德公司)，307057型空氣浴振蕩搖床(江蘇太倉豪誠實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)，5427型高速離心機(jī)(德國艾本德公司)，SpectraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀(美國Molecuar Devices LLC公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

在200 μL的反應(yīng)體系中，含有PBS緩沖液(100 mmol·L-1，pH 7.4)及適量的小鼠肝微粒體，渦旋混合均勻后，于37 ℃恒溫空氣浴共同振蕩孵育活化10 min，向體系中分別添加適量的熒光探針BMBT(hCE1特異性底物)和FDA(hCE2特異性底物)起始反應(yīng)，37 ℃振蕩孵育20 min后，加入等體積冰乙腈渦旋終止反應(yīng)，8000 r·min-1離心3 min去除蛋白。移取200 μL上清液至96孔板，于熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度(FDA水解產(chǎn)物F激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm；BMBT水解產(chǎn)物HBMT激發(fā)波長(zhǎng)為304 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm)。

2.1.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.1.1 底物濃度優(yōu)化 肝微粒體濃度保持2 μg·mL-1(BMBT)，0.2 μg·mL-1(FDA)，將底物濃度設(shè)為1、2、5、10、20、30 μmol·L-1；酶活化后加入探針底物，反應(yīng)2 min，每15 s測(cè)定熒光強(qiáng)度，時(shí)間和熒光強(qiáng)度線性擬合得到的斜率即為反應(yīng)速率，將底物濃度和反應(yīng)速率代入米氏方程進(jìn)行非線性擬合得到動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km。

2.1.1.2 肝微粒體濃度優(yōu)化 采用接近Km的底物濃度，將肝微粒體質(zhì)量濃度設(shè)為0.25、0.5、1、2、3 μg·mL-1(底物為BMBT)，0.1、0.15、0.2、0.3、0.5 μg·mL-1(底物為FDA)；按2.1方法測(cè)量熒光強(qiáng)度，繪制酶濃度-熒光強(qiáng)度曲線。

2.1.1.3 DMSO用量?jī)?yōu)化 采用優(yōu)化好的底物濃度和肝微粒體濃度，將溶解探針底物的DMSO用量設(shè)為0%、1%、2%、3%(V/V)；按2.1方法測(cè)量熒光強(qiáng)度，按公式(1)計(jì)算羧酸酯酶殘余活性。

(1)

2.1.1.4 乙腈用量?jī)?yōu)化 采用優(yōu)化好的底物濃度和肝微粒體濃度，在活化時(shí)分別加入0%、50%、75%、100%(V/V)的冰乙腈，再按2.1方法離心后向反應(yīng)體系中補(bǔ)加冰乙腈，使冰乙腈終體積均為200 μL，取200 μL上清液至96孔板，于熒光酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度，計(jì)算羧酸酯酶殘余活性。

2.1.2 三七總皂苷對(duì)羧酸酯酶的抑制作用 采用優(yōu)化好的酶促反應(yīng)條件，將三七總皂苷質(zhì)量濃度設(shè)為1、10、100 μg·mL-1，與酶共孵育活化，按2.1方法測(cè)量熒光強(qiáng)度，并公式(2)計(jì)算對(duì)羧酸酯酶活性的抑制率。陰性對(duì)照(等體積PBS代替三七總皂苷)和陽性對(duì)照(等體積羧酸酯酶陽性抑制劑BNPP，終濃度100 μmol·L-1代替三七總皂苷)在相同條件下反應(yīng)。選擇抑制效果較為明顯的羧酸酯酶亞型，將三七總皂苷質(zhì)量濃度設(shè)為1、5、10、20、50、100、300、500、700 μg·mL-1，計(jì)算三七總皂苷對(duì)羧酸酯酶活性的抑制率，并計(jì)算IC50值。

抑制率=1-殘余活性

(2)

2.1.3 抑制類型的判斷 選擇5組三七總皂苷質(zhì)量濃度，采用優(yōu)化好的酶促反應(yīng)條件，將三七總皂苷與肝微粒體共孵育活化，按“底物濃度優(yōu)化”方法測(cè)量動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)，轉(zhuǎn)化為雙倒數(shù)方程，判斷抑制類型。

2.1.4 體外-體內(nèi)外推 通過抑制劑濃度和相對(duì)應(yīng)的雙倒數(shù)方程的斜率計(jì)算求得抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)Ki；體外-體內(nèi)外推使用的方程為：AUCi/AUC=1+C抑制劑invivo/Ki，若C抑制劑invivo/Ki<0.1，無藥物相互作用可能性；0.11，高藥物相互作用可能性[11]。

2.2 結(jié)果

2.2.1 最適反應(yīng)條件

2.2.1.1 最適底物濃度 通過米氏方程非線性擬合(如圖1)，當(dāng)?shù)孜餅锽MBT時(shí)，獲得的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km=(12.79±2.427)μmol·L-1，BMBT最適濃度為13 μmol·L-1；當(dāng)?shù)孜餅镕DA時(shí)，獲得的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km=(7.866±1.367)μmol·L-1，F(xiàn)DA最適濃度為8 μmol·L-1。

注：A.BMBT；B.FDA。圖1 小鼠肝微粒體中BMBT(A)/FDA(B)水解產(chǎn)物的動(dòng)力學(xué)行為

2.2.1.2 最適肝微粒體濃度 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，底物水解率不得高于20%。當(dāng)?shù)孜餅锽MBT時(shí)，熒光強(qiáng)度(Y)與肝微粒體濃度(X)回歸方程表示為Y=380 120X-34 674(r=0.996 0)，BMBT的最適肝微粒體濃度為2 μg·mL-1；當(dāng)?shù)孜餅镕DA時(shí)，回歸方程表示為Y=6.40×108X-1.10×107(r=0.996 5)，F(xiàn)DA的最適肝微粒體濃度為0.2 μg·mL-1。見圖2。

注：A.BMBT；B.FDA。圖2 BMBT(A)/FDA(B)水解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度隨肝微粒體濃度的線性變化

2.2.1.3 有機(jī)溶劑用量 結(jié)果表明，當(dāng)體系中存在0%～3% DMSO時(shí)，hCE1和hCE2的活性沒有顯著變化；體系中加入一半體積以上的冰乙腈可以終止酶促反應(yīng)，最終確定加入200 μL冰乙腈。

2.2.2 三七總皂苷對(duì)羧酸酯酶的抑制作用 如圖3所示，當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1時(shí)，三七總皂苷對(duì)hCE1的抑制率僅為27%；而三七總皂苷質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1時(shí)，對(duì)hCE2的抑制率達(dá)到42.1%，當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1時(shí)，抑制率為63.5%，抑制效果較為明顯(見圖4)，進(jìn)一步細(xì)化三七總皂苷濃度進(jìn)行抑制率實(shí)驗(yàn)，求得三七總皂苷對(duì)hCE2的半數(shù)抑制率IC50為17.05 μg·mL-1。

注：A.hCE1；B.hCE2；NC代表陰性對(duì)照；PC代表陽性對(duì)照。圖3 三七總皂苷對(duì)hCE1(A)/hCE2(B)活性抑制效果的初篩

圖4 三七總皂苷對(duì)hCE2活性的抑制作用

2.2.3 抑制類型 通過雙倒數(shù)方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，所得的雙倒數(shù)擬合直線相交于X軸(如圖5)，說明三七總皂苷對(duì)hCE2的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)型抑制；將各斜率和對(duì)應(yīng)的三七總皂苷濃度進(jìn)行方程擬合，所得函數(shù)為Y=0.003 7X+0.29，進(jìn)一步計(jì)算求得三七總皂苷對(duì)hCE2的Ki為77.53 μg·mL-1。

2.2.4 體內(nèi)藥-藥相互作用的發(fā)生可能性 大鼠在灌胃三七總皂苷(600 mg·kg-1)后，采用整合藥代動(dòng)力學(xué)的方法，擬合出三七總皂苷的Cmax為18.473 μg·mL-1[12]，將此濃度(C抑制劑)代入體外-體內(nèi)外推方程，求得C抑制劑/Ki值為0.24，這表明由于抑制hCE2活性所造成的藥物生物利用度比未服用三七總皂苷時(shí)增大了0.24倍。

注：A.雙倒數(shù)方程；B.抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)方程。圖5 三七總皂苷對(duì)hCE2活性抑制的雙倒數(shù)方程和抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)方程

3 討論

本研究證明，三七總皂苷可較明顯地直接抑制hCE2的水解活性，且通過體外-體內(nèi)外推方法證明，三七總皂苷在與經(jīng)hCE2代謝的藥物一起服用時(shí)，需要警惕藥-藥相互作用的發(fā)生。在體外水平下，三七總皂苷對(duì)hCE1的活性表現(xiàn)出微弱的直接抑制作用，但是三七總皂苷對(duì)hCE1的活性是否有間接抑制作用還需要進(jìn)一步考察：由于選擇肝微粒體作為酶源，并不存在羧酸酯酶的表達(dá)翻譯過程，但三七總皂苷還有可能通過影響hCE1的轉(zhuǎn)錄翻譯環(huán)節(jié)，從而抑制其水解活性。

羧酸酯酶的催化中心由一個(gè)包含絲氨酸催化三聯(lián)體的中央催化位點(diǎn)組成，絲氨酸殘基很容易與含羰基分子反應(yīng)形成中間體，若中間體的碳碳雙鍵無法斷裂，則會(huì)抑制催化活性。具有兩個(gè)相鄰羰基結(jié)構(gòu)1，2-二酮類分子大多可強(qiáng)烈抑制羧酸酯酶的活性[13]，而三七總皂苷中所含有的5種皂苷(三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd)均不具有這種可以和活性催化中心結(jié)合的相鄰羰基結(jié)構(gòu)，說明三七總皂苷對(duì)羧酸酯酶的抑制類型不可能是競(jìng)爭(zhēng)型抑制，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷對(duì)hCE2的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)型抑制，說明三七總皂苷與hCE2的非活性部位相結(jié)合，形成抑制物-酶的絡(luò)合物后進(jìn)一步再與底物結(jié)合；或是hCE2與底物結(jié)合成底物-酶絡(luò)合物后，其中有部分再與三七總皂苷結(jié)合。這兩種情況所形成的中間絡(luò)合物都不能直接生成水解產(chǎn)物，從而導(dǎo)致了酶催化反應(yīng)速率的降低。

三七作為一種中長(zhǎng)期服用的中藥，在腸道中對(duì)羧酸酯酶的抑制效果可能是累積作用。因此，長(zhǎng)期服用三七總皂苷，同時(shí)使用羧酸酯酶底物藥物時(shí)應(yīng)該建議進(jìn)行體內(nèi)藥物水平的監(jiān)測(cè)，必要時(shí)可調(diào)整用藥量，以確保臨床安全有效。