劉靖，郝俊杰，劉士敬*，肖小河，牛明*

1.承德醫(yī)學院，河北 承德 067000；2.中國人民解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學中心 全軍中醫(yī)藥研究所，北京 100039

阿膠是臨床常用的名貴中藥[1]，被譽為滋補圣品。近年來，隨著阿膠產(chǎn)業(yè)的不斷擴大，阿膠產(chǎn)品的質量問題也日益凸顯[2]。究其原因，主要是由于阿膠成分復雜、物質基礎不清[3]，而現(xiàn)行的質量評價方法則傾向于對阿膠真?zhèn)蔚蔫b別[4-6]，質量標準與其臨床功效脫節(jié)，難以反映其內(nèi)在品質。因此，建立關聯(lián)阿膠臨床功效的質量評價方法，對于阿膠產(chǎn)品的質量控制具有重要意義。

現(xiàn)代藥理研究表明，阿膠作為滋補藥具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用[7]，可有效促進免疫細胞增殖，改善放化療所引起的免疫低下狀態(tài)，因此調(diào)節(jié)免疫活性可作為阿膠質量生物評價方法研究的切入點。本課題組前期針對銅皮石斛[8]、鐵棍山藥[9]等補益類中藥，結合高內(nèi)涵分析的高通量檢測技術優(yōu)勢，構建了以體外巨噬細胞吞噬作用為基礎的中藥免疫調(diào)節(jié)活性評價方法，并應用于相關中藥品種的質量評控。

本文在前期研究基礎上，以小鼠單核巨噬細胞系(RAW264.7)吞噬大腸桿菌為評價模型，通過考察、優(yōu)化相關檢測條件和指標，建立了基于調(diào)節(jié)免疫活性的阿膠質量生物評價方法，該方法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好，或可為提升阿膠的質量評控能力提供參考。

1 材料

1.1 儀器

高內(nèi)涵篩選分析儀(Thermo Scientific 公司，美國)；CO2培養(yǎng)箱(三洋公司，日本)；常規(guī)倒置顯微鏡(上海澤權儀器設備有限公司)；電子天平XS-205(Mettler Toldeo公司，美國)；TC10TM自動細胞計數(shù)器(Bio-Rad公司，美國)；SynergH1全功能微孔板檢測儀(酶標儀，BioTek公司，美國)；臺式低速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)。

1.2 試劑

小鼠(Musmusculus)巨噬細胞系RAW264.7(解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心全軍中醫(yī)藥研究所)；綠色熒光標記大腸桿菌(GFP-E.coli，解放軍軍事醫(yī)學科學院)；高糖培養(yǎng)基(DMEM)、磷酸緩沖鹽溶液(1×PBS)、胎牛血清(FBS)均購于HyClone公司；4%多聚甲醛、誘導劑isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)均購于Solarbio公司；胰蛋白酶、雙抗試劑(100 g·L-1鏈霉素和100 μg·mL-1青霉素)均購于Gibco公司；lipopolysaccharide(LPS)、Hoechst染料均購于Sigma公司；LB肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術公司)；CCK-8檢測試劑(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)；96孔板(Costar 3603、3599，Corning公司，美國)；阿膠飲片(山東東阿阿膠有限公司，批號：1612031)。

2 方法

2.1 阿膠受試品制備

取阿膠樣品粉碎并過65目篩，得到阿膠粉末。精密稱取，用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基制備成質量濃度為4.0 mg·mL-1的溶液，過0.22 μm無菌濾膜后，等比稀釋至所需濃度。

2.2 RAW264.7細胞的培養(yǎng)

待細胞復蘇后，用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基在條件為含5% CO2、恒溫37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中孵育細胞。

2.3 細菌(GFP-E.coli)制備

將菌液以1%比例接種到15 mL LB肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r·min-1條件下?lián)u菌過夜，再以1%比例接種到新的培養(yǎng)基，搖菌3.5 h后加入IPTG進行誘導，在16 ℃、160 r·min-1條件下?lián)u菌過夜，得到GFP-E.coli。

2.4 細胞濃度與孵育時間考察

將處于對數(shù)生長期的細胞調(diào)整細胞數(shù)為5×104、8×104、1×105個/mL，分別種于9個96孔板，每一濃度3個復孔，設置檢測時間為4、6、12、18、24、30、36、42、48 h時加入相應的CCK-8試劑，在含5%CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃孵育30 min，最終放入波長設置為450 nm的酶標儀中檢測吸光度(A)值。

2.5 阿膠樣品影響細胞活力的檢測

實驗共分成8個組，分別為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg·mL-1組，Control組(不給藥)和空白組(不接種細胞、不給藥)，每組設置3個復孔。取對數(shù)生長期的巨噬細胞，調(diào)整細胞數(shù)，接種于96孔板中。接種12 h后，棄去上清液，加入不同濃度的阿膠受試品繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑進行檢測。酶標儀讀取A值，按公式(1)計算細胞存活率。

(1)

2.6 吞噬實驗方法

根據(jù)參考文獻[10-12]，對RAW264.7細胞吞噬GFP-E.coli的實驗方法進行優(yōu)化，在染色過程中用Hoechst核酸染料代替前期實驗[8-9]中使用的DAPI染料，以減少操作流程和縮短實驗時間，盡可能避免因實驗操作引起的誤差。最終明確實驗方法如下：細胞培養(yǎng)完成后，加入固定量的GFP-E.coli和Hoechst核酸染料，放入含5% CO2、恒溫37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育2 h；終止孵育后，用1×PBS清洗；再用4%多聚甲醛室溫固定10 min；最后用1×PBS清洗，使用高內(nèi)涵篩選儀器采集熒光圖像并分析。

2.7 數(shù)據(jù)收集與分析

2.7.1 高內(nèi)涵檢測 采用高內(nèi)涵儀器進行掃描分析，20倍物鏡，16個視野，設定Channel1檢測波長為386 nm，檢測被Hoechst核酸染料染為藍色的細胞核；Channel2檢測波長為485 nm，檢測轉染后的GFP-E.coli。使用儀器自帶分析軟件獲取數(shù)據(jù)，按公式(2)計算所有細胞的整體吞噬率，按公式(3)計算單個細胞吞噬指數(shù)。其中，吞噬指數(shù)和吞噬率均與RAW264.7細胞的吞噬能力呈正相關關系。

(2)

(3)

2.7.2 統(tǒng)計學分析 使用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，計算其組間的統(tǒng)計學差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果與分析

3.1 巨噬細胞吞噬模型構建

3.1.1 細胞密度考察與孵育時間考察 巨噬細胞RAW264.7的生長狀態(tài)與細胞密度關系密切，只有達到一定密度后才會穩(wěn)定生長。因此，本研究采用CCK-8試劑對不同密度時的細胞活性進行考察，結果見圖1。結合顯微觀察，細胞密度在1×105個/mL時接種于96孔板內(nèi)的生長狀態(tài)最好。在此條件下，細胞在種板后4 h開始貼壁生長，貼壁細胞數(shù)目較多、形態(tài)穩(wěn)定、生長迅速且不易死亡，在24 h時生長至50%左右，42 h后細胞密度處于飽和狀態(tài)，分裂減緩；在密度為8×104個/mL時，細胞持續(xù)生長，細胞形態(tài)改變數(shù)目較1×105個/mL時略多；在密度為5×104個/mL時，死亡細胞較多，細胞形態(tài)也易發(fā)生改變。綜合考慮實驗穩(wěn)定性和實驗時間的因素，選擇接種密度為1×105個/mL，吞噬實驗需在接種后24～40 h內(nèi)完成。

圖1 細胞密度考察與生長曲線的測定

3.1.2 MOI值考察 以1×105個/mL的密度將細胞接種于96孔板，共設4組，每組設3個復孔，接種12 h后進行換液，再孵育24 h后加入MOI值為25、50、100、200倍的GFP-E.coli和Hoechst核酸染料，并根據(jù)前期研究，確定加菌后的孵育時間為2 h。孵育完成后，對細胞進行處理，再使用高內(nèi)涵篩選儀器采集數(shù)據(jù)，經(jīng)軟件分析得到單個細胞吞噬指數(shù)和整體吞噬率。結果如圖2所示，吞噬率隨MOI值的增大而升高，在MOI為200倍時吞噬率達到40%左右，各組間差異具有統(tǒng)計學意義；單個細胞吞噬指數(shù)隨MOI值的增大而降低，但各組間差異無統(tǒng)計學意義。在MOI值為25倍時，吞噬指數(shù)平均值最高，為36.14，但是誤差最大(RSD≈22.54%)，在50～200倍間趨于穩(wěn)定(50、100、200倍時單個細胞吞噬指數(shù)平均值分別為31.38、28.85、28.46)，200倍時誤差最小(RSD≈5.8%)。因此，本實驗選定單個細胞吞噬指數(shù)穩(wěn)定、細胞吞噬比例接近半數(shù)的MOI值(200)作為固定條件之一，進行后續(xù)實驗。

注：A.不同倍數(shù)MOI條件下的細胞吞噬率；B.不同倍數(shù)MOI條件下的單個細胞吞噬指數(shù)；*P<0.05，**P<0.01。圖2 不同倍數(shù)MOI條件下巨噬細胞的吞噬能力分析

3.2 高內(nèi)涵篩選技術檢測阿膠對巨噬細胞吞噬功能的影響

3.2.1 樣品對細胞活力檢測 以1×105個/mL的密度將細胞接種12 h后，棄去上清液，加入上述制備的阿膠受試品，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行活力檢測。根據(jù)不同濃度阿膠對巨噬細胞存活率的影響，繪制給藥后巨噬細胞活力圖。如圖3所示，質量濃度在0.125～2.0 mg·mL-1的阿膠對細胞活力影響均為無毒性作用。在0.125、0.25、0.5、1.0 mg·mL-1時，阿膠溶液具有明顯促進巨噬細胞增殖作用，并在0.25、0.5 mg·mL-1時差異具有統(tǒng)計學意義，細胞存活率平均值分別為110.22%、114.73.%、122.88%、108.77%；在2.0 mg·mL-1時，阿膠對巨噬細胞增殖無明顯作用，與Control組幾乎持平；在4.0 mg·mL-1時，與Control組相比，阿膠對巨噬細胞呈抑制作用。實驗中各樣品的重復性良好，RSD均<15%，符合生物評價的要求。因此選定進行阿膠吞噬實驗的劑量為對巨噬細胞(RAW264.7)的無毒劑量，即0.125～2.0 mg·mL-1。

注：與Control組對比，**P<0.01。圖3 給藥阿膠后細胞存活率測定

3.2.2 阿膠對巨噬細胞吞噬功能的影響 實驗共分成7組，分別為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg·mL-1組，陽性藥LPS(250 ng·mL-1)組和Control組(不給藥)，每組設置3個復孔。細胞完成給藥培養(yǎng)后加入配置好的細菌(MOI=200)和Hoechst核酸染料，孵育時間2 h后，進行清洗和固定。使用高內(nèi)涵篩選儀器采集熒光圖像，掃描結果見圖4。

從圖4的巨噬細胞吞噬表型中可見，給藥阿膠后，吞噬GFP-E.coli的巨噬細胞數(shù)量發(fā)生明顯變化，隨著阿膠質量濃度的增加，吞噬GFP-E.coli的細胞占比與阿膠質量濃度有明顯的劑量依賴性。通過圖5數(shù)據(jù)分析，由圖5A中各組吞噬百分率的變化可見，隨著阿膠質量濃度的變化，細胞吞噬百分率增大，說明阿膠對巨噬細胞吞噬功能具有劑量依賴的促進作用，并且與Control組相比，在0.125、0.25、0.5、1.0 mg·mL-1時，阿膠具有明顯促進巨噬細胞吞噬的作用，差異具有統(tǒng)計學意義；在2.0 mg·mL-1時，與Control組相比，阿膠對巨噬細胞吞噬能力呈現(xiàn)出略微抑制的作用；由圖5B中各組單個細胞吞噬指數(shù)的變化可見，阿膠可能降低了單個細胞吞噬GFP-E.coli的能力，在0.125 mg·mL-1時最為顯著，差異具有統(tǒng)計學意義，但是隨著劑量的升高，單個細胞吞噬指數(shù)呈現(xiàn)回升的趨勢。

注：藍色熒光為巨噬細胞；綠色熒光表示GFP-E.coli。圖4 阿膠不同給藥濃度下巨噬細胞吞噬作用的表型圖

注：A.細胞吞噬率；B.單個細胞吞噬指數(shù)；與Control組對比，*P<0.05，**P<0.01。圖5 阿膠不同給藥濃度下巨噬細胞的吞噬能力分析

4 討論

阿膠作為臨床常用的名貴中藥，其關聯(lián)的臨床功效質量評價方法的缺失，是導致長期以來阿膠產(chǎn)品質量問題備受關注的重要原因之一。本研究針對阿膠調(diào)節(jié)免疫的藥理活性，建立了基于巨噬細胞吞噬作用的阿膠質量生物評價方法。研究結果表明，阿膠具有促進巨噬細胞增殖和提高其吞噬能力的雙重作用，并在阿膠質量濃度為0.125～1 mg·mL-1時呈現(xiàn)較好的劑量依賴關系，與現(xiàn)有的藥理研究結論相一致[13]。并且本研究發(fā)現(xiàn)，阿膠兩種生物活性的量效曲線略有差異，其質量濃度為0.5 mg·mL-1時對細胞的增殖效果最好，而0.25 mg·mL-1時提高吞噬的作用最強。這一結果提示，阿膠兩種生物活性作用的藥效物質可能有所差異，因此采用上述方法對阿膠質量進行評價時，應當同時關注增殖作用和吞噬作用兩個方面。同時，針對阿膠影響巨噬細胞吞噬能力的分析表明，阿膠的作用主要表現(xiàn)在激活巨噬細胞吞噬活性，提高細胞的吞噬比率，而對于單個細胞吞噬能力的調(diào)節(jié)作用從整體來看并不明顯；因此本研究認為，細胞增殖率和細胞整體吞噬率的變化可作為重要指標，用于阿膠質量的評價。

此外，巨噬細胞作為機體的重要免疫細胞，無論是其細胞數(shù)量的增減還是吞噬活力的變化均可能影響機體的免疫功能[14-17]。本文研究結果中，隨著MOI值的升高，吞噬率不斷升高，而單個細胞吞噬指數(shù)趨于平穩(wěn)，提示單個細胞的吞噬能力在高倍的GFP-E.coli刺激下已達到飽和狀態(tài)；因此，給藥阿膠后的實驗結果提示，阿膠的調(diào)節(jié)免疫作用可表現(xiàn)為促進細胞增殖和激活未活化的巨噬細胞以提高整體吞噬率，但是不能增強巨噬細胞自身的吞噬能力。這可能是阿膠性味平和的一種體現(xiàn)，與阿膠常用于治療機體免疫力低下、免疫細胞缺乏等相關疾病的臨床應用相一致[17-18]，但其明確的作用機制有待進一步研究。

綜上，本研究成功構建了以巨噬細胞吞噬GFP-E.coli為生物模型、以細胞增殖率和細胞整體吞噬率為評價指標的阿膠質量生物評價方法。該方法以高內(nèi)涵熒光成像篩選技術為基礎，具有高通量、高分辨率和多參數(shù)等優(yōu)勢[19-20]，可快速、直觀地評價藥品的生物活性，實驗的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較好，且對樣品的需求量小，適用于阿膠等藥效物質不清的名貴中藥質量評價。