張香，劉娟，袁媛，楊全，周良云，楊健，王健，趙玉洋，黃璐琦，

1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100500

白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg為瑞香科Thymelaeaceae沉香屬熱帶及亞熱帶常綠喬木，為中國特有的珍稀瀕危藥源植物，其含樹脂的干燥木材作為國產(chǎn)沉香使用[1-2]。沉香在傳統(tǒng)醫(yī)藥、宗教、香料領(lǐng)域用途廣泛，但其形成速度極為緩慢，導(dǎo)致野生資源被過度砍伐[3-4]。近年來，白木香人工種植面積逐漸增加，如何實(shí)現(xiàn)白木香非藥用部位的開發(fā)與可持續(xù)利用對(duì)推動(dòng)沉香行業(yè)發(fā)展具有重要意義。

目前，人工種植的白木香林每年可生產(chǎn)大量果實(shí)，其果皮具有特殊香味，研究表明白木香果皮含有葫蘆素型四環(huán)三萜、黃酮、甾醇及沉香特征性成分倍半萜等成分，具有抗腫瘤及抗菌等活性[5-8]。本課題組通過前期白木香基地調(diào)研，發(fā)現(xiàn)熟化后白木香果皮具有類似沉香的氣味。研究表明，陳皮在熟化(又稱陳化)過程中揮發(fā)油組分發(fā)生很大改變[9-10]，然而關(guān)于白木香果皮熟化方面的研究及應(yīng)用未見報(bào)道。本研究首次報(bào)道白木香果皮6個(gè)不同熟化時(shí)期揮發(fā)性成分的差異，為全面合理開發(fā)白木香非藥用部位奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

白木香果實(shí)采自廣東省東莞市白木香基地，根據(jù)果皮不同的熟化時(shí)期分為Ⅰ期(新鮮采摘期)、Ⅱ期(30 ℃，濕度30%，放入密閉容器熟化48 h)、Ⅲ期(30 ℃，濕度30%，放入密閉容器熟化96 h)、Ⅳ期(30 ℃，濕度30%，放入密閉容器熟化144 h)、Ⅴ期(30 ℃，濕度30%，放入密閉容器熟化15 d)和Ⅵ期(30 ℃，濕度30%，放入密閉容器熟化20 d)(圖1)，每個(gè)時(shí)期6批樣品。去除果實(shí)內(nèi)的種子，果皮冷凍干燥后打粉備用。

假設(shè)Bob要在互聯(lián)網(wǎng)上向Alice轉(zhuǎn)賬，每次轉(zhuǎn)賬都會(huì)產(chǎn)生交易記錄，將所有的交易記錄進(jìn)行連接，生成總帳單，總賬單包含每個(gè)人的余額。記賬時(shí)，應(yīng)需保持公平、誠信的態(tài)度，使得雙方能夠相互信任；但記賬人可能會(huì)作假，使得雙方的信任程度降低，這是很典型的欺詐行為。區(qū)塊鏈技術(shù)則可以很好地解決這一問題，沒有人可以作假。

TRACE 1310/TSQ 8000型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司)；石英毛細(xì)管柱(TG-5 MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Thermo公司)；萬分之一天平(瑞士梅特勒斯公司)；SB-800 DTD型超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；球磨儀(MM 400混合型球磨儀，Retsch公司)；乙酸乙酯為分析純。

樣品總離子流圖導(dǎo)入賽默飛GC-MS Trace Finder 3.3軟件，在與NIST 2.2質(zhì)譜庫比對(duì)結(jié)果中，當(dāng)色譜峰強(qiáng)度>1×105，質(zhì)譜圖與NIST質(zhì)譜庫的質(zhì)譜圖正向比對(duì)結(jié)果大于500的峰確定為所鑒別的物質(zhì)。自動(dòng)質(zhì)譜解卷積和識(shí)別系統(tǒng)(AMDIS)軟件用于自動(dòng)去卷積后分析色譜峰的純度和保留時(shí)間-特征離子列表的獲取，根據(jù)該軟件提取峰面積[12]。本研究采用主成分分析(PCA)，在建模前，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行pareto 預(yù)處理，之后通過SIMCA 14.1軟件進(jìn)行分析。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

應(yīng)用GC-MS技術(shù)對(duì)各樣品成分進(jìn)行分析，通過Trace Finder 3.3工作站處理樣品總離子流圖，清除背景及圖譜重疊的干擾，結(jié)合NIST 2.2數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)信息比對(duì)，對(duì)色譜峰進(jìn)行鑒定，并采用峰面積歸一化法計(jì)算各化合物的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。分析結(jié)果顯示，不同熟化時(shí)期共比對(duì)出207種化合物，包括單萜5個(gè)、倍半萜16個(gè)、二萜2個(gè)、三萜2個(gè)、甾體14個(gè)、類萜4個(gè)、生物堿15個(gè)、脂肪酸46個(gè)、烷烴60個(gè)、烯烴4個(gè)及其他類化合物39個(gè)(表1)，其中烷烴與脂肪酸在果皮中的種類與含量最高，與前人報(bào)道一致[8，13]。對(duì)6個(gè)階段不同成分的含量比例進(jìn)行分析(圖2)，結(jié)果表明，單萜、三萜在未熟化前(Ⅰ期、Ⅱ期)含量低于檢測(cè)限，而隨著熟化時(shí)間增加，單萜與三萜含量先上升后下降；甾體成分在Ⅱ期產(chǎn)生，在Ⅵ期含量最高，分析發(fā)現(xiàn)甾體成分最后時(shí)期主要增加的是麥角甾醇，可能與陳化后期微生物代謝物增加有關(guān)；倍半萜在未熟化前(Ⅰ期)含量極低，而隨著熟化時(shí)間增加，含量逐漸增加，在熟化96 h后含量最高(Ⅲ期)，之后下降；類萜則在熟化后144 h后含量較低(Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期，相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)<0.11%)。以上結(jié)果均表明，在果皮熟化過程，化學(xué)成分的組成與含量發(fā)生明顯變化，其中萜類相關(guān)的代謝變化突出，而沉香中最重要的成分之一為倍半萜，因此作者有必要對(duì)以上萜類成分進(jìn)行進(jìn)一步分析。

2.2 GC-MS條件

(3) 由鶴式起重機(jī)機(jī)構(gòu)的可靠性分析結(jié)果可知，為了保證起重的等勢(shì)性,必須嚴(yán)格控制桿件1、桿件2的加工和裝配精度.

進(jìn)一步分析前4個(gè)時(shí)期的化學(xué)成分特征，又建立了這4個(gè)時(shí)期化學(xué)成分的PCA圖，發(fā)現(xiàn)Ⅲ、Ⅳ期與其他熟化時(shí)期明顯分開，化學(xué)成分發(fā)生顯著改變，Ⅰ期和Ⅱ期成分變化較??；在建立模型時(shí)，擬合參數(shù)Q2(cum)=0.69，R2X(cum)=0.805，當(dāng)Q2>0.5與R2X接近1時(shí)，表示分離效果好(圖5)。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

“體”—多面架構(gòu)成體，實(shí)現(xiàn)多層面、多維度的深度協(xié)同，具體形式是“教師教育實(shí)驗(yàn)區(qū)”。以區(qū)域教師進(jìn)修院校為紐帶，緊密聯(lián)系高等院校和中小學(xué)教師形成研修聯(lián)盟，改變教師發(fā)展場(chǎng)域，由高校引領(lǐng)理論方向，中小學(xué)提供教學(xué)實(shí)踐，實(shí)現(xiàn)多層面、多學(xué)科、多維度的教學(xué)研究，形成群體共振效應(yīng)，整體提升中小學(xué)教師的教學(xué)能力。

圖1 不同熟化時(shí)期的白木香果皮

3 結(jié)果

3.1 不同熟化時(shí)期白木香果皮化學(xué)成分分類

精密稱取果皮粉末0.1 g，置于2 mL離心管中，精密加入乙酸乙酯1.5 mL，密封管口，樣品于室溫下浸泡過夜；超聲(40 kHz)冷提45 min，12000 r·min-1，離心10 min，稱重，加乙酸乙酯補(bǔ)足失重，取上清液置于新的離心管中，氮吹濃縮至溶劑揮干，精密加入乙酸乙酯200 μL，充分震蕩混勻后用0.22 μm聚四氟乙烯(PTFE)濾膜濾過，得續(xù)濾液，即供試品溶液，4 ℃儲(chǔ)存，備用。

圖2 不同種類化學(xué)成分在6個(gè)熟化時(shí)期含量的百分比

3.2 不同熟化時(shí)期果皮中萜類及沉香特征性成分分析

采用主成分分析(PCA)法分析不同熟化時(shí)期的白木香果皮成分，將各化合物相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)矩陣歸一化處理后導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件中進(jìn)行PCA-X判別分析，結(jié)果如圖4所示。在建立模型時(shí)，擬合參數(shù)Q2(cum)=0.791，R2X(cum)=0.875，當(dāng)Q2>0.5與R2X接近1時(shí)，表示白木香果皮不同熟化時(shí)期揮發(fā)性成分分離效果好。當(dāng)熟化時(shí)間超過2 d后(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ期)，白木香果皮的成分結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，尤其超過10 d后(Ⅴ、Ⅵ期)，白木香果皮中成分發(fā)生了顯著變化(圖4)。

表1 不同熟化時(shí)期白木香果皮化學(xué)成分含量與數(shù)目

注：A.相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；B.化合物數(shù)目。

倍半萜類化合物是沉香特征性成分之一[15]，在不同熟化時(shí)期中共檢出16種倍半萜類成分(見表3)。Ⅰ期倍半萜含量極低，主要為桉葉烷型倍半萜；Ⅱ期到Ⅳ含量較Ⅰ期顯著性增加，倍半萜種類更加豐富，除了桉葉烷型倍半萜外還增加了愈創(chuàng)木烯型和螺旋烷型倍半萜，倍半萜的種類及含量在Ⅲ期最多，而后下降。

GC條件在前人基礎(chǔ)上優(yōu)化[11]，色譜柱為TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛細(xì)管柱。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，不分流；載氣為高純度氦氣(純度≥99.999%)，柱流量N2，進(jìn)樣量1 mL·min-1。升溫程序：從50 ℃從開始以10 ℃·min-1升到155 ℃，保留15 min；再以8 ℃·min-1升到280 ℃，保留10 min。

注：**P<0.01。圖3 不同熟化時(shí)期白木香果皮5種萜類成分含量比較

表2 不同熟化時(shí)期果皮中類萜成分的含量 %

表3 不同熟化時(shí)期果皮中倍半萜成分含量 %

3.3 主成分分析

由于白木香果皮熟化過程中萜類代謝變化顯著，作者對(duì)其中的5類成分進(jìn)一步分析(圖3)。結(jié)果表明，倍半萜、單萜分別隨著熟化程度增加含量升高，到Ⅲ期含量最多；而類萜則在Ⅲ期后含量極速下降；三萜僅在Ⅳ期能檢測(cè)到，其他時(shí)期都在檢測(cè)限下；甾體類成分在最后熟化Ⅵ期含量最高，其中麥角甾醇含量高達(dá)8.45%，可能與熟化后期微生物代謝有關(guān)。該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的類萜成分為角鯊烯、α-生育酚、γ-生育酚、g-生育酚(表2)；角鯊烯是合成三萜和甾體的重要前體，隨著熟化過程的進(jìn)行，角鯊烯含量先升高后下降，表明熟化促進(jìn)萜類代謝途徑上游通路產(chǎn)生角鯊烯，而后隨著下游三萜與甾醇形成，角鯊烯不斷被消耗，至Ⅳ期后其含量下降；生育酚為重要的抗氧化劑，在Ⅰ、Ⅱ期含量較多，Ⅲ、Ⅳ期含量下降直至檢測(cè)限下，表明熟化后期過氧化程度增加，而過氧化可以激活沉香萜類代謝等[14]。

MS條件：離子源為EI源，電離電壓70 eV，離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z為50～500。

圖4 6個(gè)熟化時(shí)期白木香果殼主成分分析結(jié)果(PCA-X)

圖5 Ⅰ～Ⅳ期白木香果殼主成分分析結(jié)果(PCA-X)

4 討論

白木香結(jié)香部位主要有倍半萜類化合物、2-(2-苯乙基)色酮、芳香族化合物、三萜類化合物等[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，熟化后白木香果實(shí)中存在大量萜類成分，但種類、數(shù)目分布因熟化時(shí)間不同而有所差異。倍半萜、單萜、三萜分別隨著熟化程度增加含量先升高后降低，而類萜則在Ⅲ期后含量極速下降。進(jìn)一步對(duì)沉香特征性成分倍半萜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)沉香螺醇、β-桉葉烯、β-桉葉醇等均在新鮮期含量低于檢測(cè)限，而熟化Ⅱ-Ⅳ期含量均顯著增加；個(gè)別倍半萜如α-愈創(chuàng)木烯僅在Ⅱ期時(shí)被檢測(cè)到，之后含量均在檢測(cè)限下，該成分可能是其他倍半萜的前體。

情境教學(xué)不能過于形式化，所謂的形式化是指單一地注重形式的豐富，這樣就會(huì)本末倒置。就好比為學(xué)生精心創(chuàng)設(shè)詩情畫意的課文情境，卻在鍛煉學(xué)生語言文字上過于粗糙簡(jiǎn)單，沒有分清課堂內(nèi)容和形式的主次關(guān)系，這種情境教學(xué)所帶來的作用就是開創(chuàng)了學(xué)生的眼界，加深了對(duì)課堂新奇事物的記憶，沒有什么實(shí)質(zhì)上的收獲。

PCA分析結(jié)果表明，Ⅴ、Ⅵ期的白木香果殼成分發(fā)生明顯變化，可能因熟化后期微生物增多有關(guān)；在前4個(gè)時(shí)期中，Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期的白木香果殼成分可明顯區(qū)分，說明熟化48 h后白木香果殼的代謝流發(fā)生明顯改變。研究結(jié)果表明，白木香果皮熟化96 h所含沉香特征性成分的種類與含量最豐富，可在此條件基礎(chǔ)上進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化與開發(fā)。

此外，在臨床上白木香果殼提取物具有清除DPPH自由基、抑制絡(luò)氨酸酶活性的作用[18]，這可能與白木香果殼富含維生素E(生育酚)有關(guān)；而在香精與香料行業(yè)中，白木香果殼中的辛酸、肉豆蔻酸與水楊酸芐酯等脂質(zhì)類成分經(jīng)過加工可制成香料，如人造食用香精或花香香料[19-20]。本研究結(jié)果則提示，不同熟化程度的果皮成分變化較大，可根據(jù)后期提取目的不同，選擇不同熟化程度的白木香果皮，為全面合理開發(fā)白木香非藥用部位實(shí)現(xiàn)白木香的可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。

馬飚，中國作協(xié)會(huì)員，攀鋼員工，研究生學(xué)歷。在《詩刊》《星星》《詩探索》《文學(xué)自由談》《詩潮》及各類選本發(fā)表詩歌1000余首，2015年獲《星星》詩刊全國大獎(jiǎng)賽一等獎(jiǎng)。