李博林， 趙丹陽， 杜朋麗， 才艷茹， 何芳， 景璇， 楊倩， 胡婧楠， 李剛

（河北省中醫(yī)院，河北石家莊 050011）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因尚不明確的慢性炎癥性疾病，病變主要累及結、直腸部位，臨床表現(xiàn)以黏液膿血便、腹痛、腹瀉、里急后重為主。近年來，隨著生活方式、飲食結構的不斷改變，我國UC發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。本病病程長、易反復，嚴重影響患者生活質量。目前多認為該病與遺傳因素、環(huán)境因素、免疫因素等有關[2]。在UC的致病因素中，免疫功能異常成為近年來研究的熱點之一，尤其是核因子κB（NF-κB），其參與介導了一系列免疫炎癥反應，在UC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。本課題組前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)UC的主要病機為濁毒內蘊[4]，以此立論的化濁解毒方治療UC療效確切[5-8]，但其具體作用機制尚不明確?；诖?，本研究觀察化濁解毒方對UC模型大鼠血清IL-1β、IL-8及黏膜組織NF-κB mRNA表達的影響，以探討其作用機制，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡清潔級雄性Wistar大鼠60只，體質量（120±20）g，購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（冀）2015-1-003，動物合格證號：1710300。于室溫20～25℃飼養(yǎng)，濕度50%～70%，予普通飼料適應性喂養(yǎng)7 d后分組造模。

1.2 藥物 化濁解毒方（組成：佩蘭15 g，藿香12 g，茵陳蒿15 g，鳳尾草15 g，飛揚草15 g，澤瀉6 g，蒼術12 g，厚樸6 g，胡黃連12 g，石榴皮12 g，地榆15 g，兒茶6 g，烏梅9 g，仙鶴草15 g，白芍15 g，佛手12 g），是由廣州一方制藥有限公司提供的免煎顆粒制劑。將藥物溶于80℃的蒸餾水中，配成質量濃度為5 g/mL的混懸液備用。美沙拉嗪腸溶片，規(guī)格為0.25 g/片，國藥準字H19980148，由葵花藥業(yè)集團佳木斯鹿靈制藥有限公司提供，研缽研成細粉，溶于蒸餾水配成0.3 g/kg溶液。

1.3 試劑與儀器 2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS；美國Sigma公司）；無水乙醇（天津永大化學試劑有限公司）；白細胞介素（IL）-1β、IL-8酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）；逆轉錄—聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）。酶聯(lián)免疫檢測儀（芬蘭雷伯公司）；實時熒光PCR定量儀（美國Thermo Fisher儀器有限公司）；低溫離心機（美國Sigma公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)（武漢同濟醫(yī)科大學）。

1.4 模型制備 將60只雄性Wistar大鼠按照隨機數(shù)字表分為正常組15只和造模組45只。采用TNBS/乙醇復合法建立UC大鼠模型[9]。具體操作方法：將5%TNBS與50%乙醇等體積混合為造模劑，造模組大鼠禁食不禁水24 h后稱質量，乙醚麻醉；將造模劑按照4 mL/kg的劑量用直徑約2 mm橡膠管推入距離肛門約6～8 cm的腸腔內，提起大鼠尾部倒置30 s，再捏緊大鼠肛門平放8～10 min。正常組予相同體積9 g/L NaCl溶液。造模結束后，將大鼠放回籠內，常規(guī)飼養(yǎng)。造模期間，造模組大鼠死亡1只。造模3 d后，于造模組隨機抽取大鼠2只，斷頭處死，取結腸組織鏡下觀察，若見水腫、充血、糜爛、潰瘍形成等病理改變，即可判斷造模成功。

1.5 分組及給藥 將造模成功的42只大鼠按照隨機數(shù)字表隨機分為3組，即UC模型組、美沙拉嗪組及化濁解毒方組，每組14只。根據(jù)“動物與人體的每公斤體質量劑量折算系數(shù)表”計算大鼠灌胃中藥劑量，成人與大鼠的折算系數(shù)為6.25，大鼠每日用藥劑量=成人每日用藥總量/一般成人體質量（60 kg）×6.25?；瘽峤舛痉浇M：給予化濁解毒方混懸液（劑量為20.0 g·kg-1·d-1）灌胃；美沙拉嗪組：給予美沙拉嗪混懸液（劑量為0.3 g·kg-1·d-1）灌胃；正常組：常規(guī)飼養(yǎng)；UC模型組：給予9 g/L NaCl溶液（劑量為4.0 mL·kg-1·d-1）灌胃。連續(xù)給藥14 d。

1.6 標本采集及處理 連續(xù)給藥14 d后，各組大鼠禁食不禁水24 h，稱質量后予水合氯醛麻醉，開腹，股動脈取血2 mL置于試管中，血液凝固后分離血清，保存于-20℃冰箱備用。同時迅速在距離肛門8 cm處剪取病變結腸組織1 cm×1 cm，生理鹽水沖洗，固定于體積分數(shù)為10%的中性緩沖福爾馬林液24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片，蘇木素—伊紅（HE）染色備用。

1.7 指標檢測

1.7.1 疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分 參照Murano等[10]制定的方法，DAI=（體質量下降分數(shù)+便血分數(shù)+大便性狀分數(shù)）/3。

1.7.2 結腸黏膜組織大體觀及病理學觀察 大鼠處死后，取全結腸，生理鹽水沖洗干凈，肉眼下觀察結腸黏膜的充血、水腫、糜爛、壞死、出血等情況。顯微鏡下觀察結腸組織病理學變化情況，包括有無炎性細胞浸潤、腺體結構是否完整、有無潰瘍等情況。

1.7.3 采用ELISA法測定血清中IL-1β、IL-8含量具體操作按試劑盒說明進行。操作如下：采用抗人IL-1β/IL-8單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的IL-1β/IL-8與單抗結合，加入生物素化的抗人IL-1β/IL-8，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色。加終止液硫酸，顏色變深，在492 nm處測光密度（D）值。IL-1β/IL-8濃度與D（492 nm）值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中IL-1β、IL-8濃度。

1.7.4 采用RT-PCR法檢測結腸黏膜組織中NF-κB mRNA表達情況 具體操作：采用Trizol法提取結腸黏膜組織總RNA，使用分光光度計檢測260/280 nm處總RNA濃度后，開始反轉錄。反轉錄反應體系為20 μL，具體操作參照RT試劑盒說明進行。PCR擴增反應體系20 μL，NF-κB上游引物為5’-CTACCCCGAAATCAA AGACAAG-3’，下游引物為5’-ACTCTTGGCACAATCTCTAGGC-3’。以β-actin為內參。PCR反應程序如下：95℃30 s預變性，40個循環(huán)，95℃5 s變性，59.7℃30 s退火，72℃30 s采集熒光。使用Sequence Delection Soft Wareversion 1.2.3軟件分析PCR過程中樣本的CT值。通過2-△△CT計算NF-κB mRNA相對表達水平（p）。

1.8 統(tǒng)計方法 采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，以均進行正態(tài)性和方差齊性檢驗。多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠DAI評分比較 表1結果顯示：與正常組比較，UC模型組大鼠DAI評分升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與UC模型組比較，2個治療組DAI評分顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與美沙拉嗪組比較，化濁解毒方組DAI評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠DAI評分比較Table 1 Comparison of DAI score in various groups (-x±s)

2.2 各組大鼠結腸黏膜組織大體觀及病理學比較 圖1結果顯示：與正常組比較，各造模組大鼠結腸黏膜表面均有不同程度的充血、水腫、糜爛等表現(xiàn)。其中，UC模型組最為嚴重，黏膜可見糜爛、水腫，部分出現(xiàn)潰瘍及壞死，鏡下腺體排列紊亂，大量炎性細胞浸潤。與UC模型組比較，2個治療組大鼠結腸黏膜均有不同程度緩解，化濁解毒方組黏膜表現(xiàn)接近正常組，其表面較光滑，水腫、充血不明顯，可見愈合的潰瘍面，黏膜腺體結構完整，偶有少量炎性滲出。美沙拉嗪組大鼠結腸黏膜表面欠光滑，可見少量水腫、糜爛及表淺潰瘍形成，黏膜腺體結構基本完整，可見部分炎性細胞浸潤。

圖1 各組大鼠結腸黏膜組織病理學觀察（HE染色，×40）Figure 1 Comparison of pathological features of colonic mucosal tissues in various groups（by HE staining，×40）

2.3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-8含量比較 表2結果顯示：與正常組比較，UC模型組大鼠血清中IL-1β、IL-8含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與UC模型組比較，2個治療組大鼠血清中IL-1β、IL-8含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與美沙拉嗪組比較，化濁解毒方組血清中IL-1β、IL-8含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠結腸黏膜組織中NF-κB mRNA表達比較 表2結果顯示：與正常組比較，UC模型組結腸黏膜組織NF-κB mRNA表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與UC模型組比較，2個治療組大鼠結腸黏膜組織中NF-κB mRNA表達水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與美沙拉嗪組比較，化濁解毒方組結腸黏膜組織中NF-κB mRNA表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-8含量及結腸黏膜組織NF-κB mRNA表達水平比較Table 2 Comparison of the serum contents of IL-1β and IL-8，and colonic mucosal expression level of NF-κB mRNA in various groups (-x±s)

3 討論

UC是一種病因及發(fā)病機制尚不完全明確的慢性非特異性炎癥性腸病。現(xiàn)代研究多認為，免疫異常是UC發(fā)生發(fā)展中的關鍵環(huán)節(jié)，而細胞因子在介導異常免疫反應中起重要作用。IL-1β是一種由單核巨噬細胞產(chǎn)生的致炎因子，可以激活樹突樣細胞吞噬抗原，釋放抗原片段，參與免疫反應的持續(xù)與放大[11]。同時IL-1β也可誘導單核細胞及中性粒細胞趨化，分泌白三烯等大量炎癥物質，使腸道黏膜喪失上皮屏障功能，從而加重炎癥反應[12]。IL-8是在內源性及外源性因子刺激下產(chǎn)生的一種多肽因子。IL-8具有趨化和激活中性粒細胞等炎性細胞的作用，增加過氧化物及溶酶體酶數(shù)量，增強自然殺傷細胞的細胞毒性，參與UC發(fā)病過程[13]。NF-κB作為一種具有多向轉錄調節(jié)作用的轉錄因子，廣泛存在于各類組織中，主要參與免疫應答、炎癥反應、組織修復等基因信息的表達[14]。研究發(fā)現(xiàn)，活化后的NF-κB能夠結合細胞核基因的增強子或啟動子，調節(jié)基因轉錄，激活相關細胞應激基因，產(chǎn)生如IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子[15]。NF-κB在UC的發(fā)生發(fā)展中起到了樞紐作用[3]。

在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中并沒有UC病名記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可以將本病歸屬為“久痢”、“痢疾”等范疇[16]。古代醫(yī)家多認為素體脾虛為UC發(fā)病基礎，飲食不節(jié)（潔）、情志失調皆為常見病因，病理性質屬本虛標實。本課題組經(jīng)過大量臨床實踐發(fā)現(xiàn)，“濁毒內蘊”是本病的主要病機。現(xiàn)代飲食偏于肥甘厚味，日久則脾胃不和，運化失司，水濕內停，氣機阻滯，濕熱蘊結，濕久則化濁，熱久而蘊毒，濁毒內蘊，與氣血搏結，損傷腸絡，血肉腐敗化膿。針對此病機，本課題組自擬化濁解毒方治療UC。方中佩蘭“辛平能散結滯，芬芳能除穢惡”（《本草經(jīng)疏》），乃祛濁要藥，與藿香合用共奏化濁辟穢之功。鳳尾草、飛揚草清熱利濕解毒，亦有收斂止痢之效。四藥合用化濁解毒，直擊病源。茵陳蒿、澤瀉利濕清熱，化濁解毒?，F(xiàn)代藥理研究表明，茵陳可參與機體免疫調節(jié)，同時對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等有不同程度的抑制作用。佛手、厚樸理氣寬中，“調氣則后重自除”。地榆苦寒，涼血止血、療瘡解毒，兒茶活血化瘀、收斂生肌，胡黃連清熱涼血燥濕，仙鶴草收斂止血解毒，四藥合用“行血則便膿自愈”。石榴皮、烏梅澀腸止瀉，蒼術健脾止痢，白芍行氣和血，緩急止痛。諸藥合用，化濁解毒，調氣和血，諸癥向愈。

本研究結果顯示：經(jīng)化濁解毒方治療后，UC大鼠體質量、便血、糞便性狀等一般情況均得到顯著改善，鏡下結腸黏膜恢復良好，血清中IL-1β、IL-8含量及結腸黏膜NF-κB mRNA表達水平顯著降低。提示化濁解毒方可能是通過改善NF-κBmRNA表達，抑制相關炎癥因子的表達，達到修復受損腸黏膜、治療UC的目的。