李潔 孫濤 孫玉霜 曹建森 劉建文

1.天津市動物疫病預防控制中心

2.天津市西青區(qū)畜牧獸醫(yī)站

布魯氏菌病（Brucellosis），又稱地中海弛張熱、馬耳他熱、波浪熱，是由布魯氏菌引起的人和牛、羊、豬等的重要人畜共患病。羊是重要易感動物,以母畜流產(chǎn)和公畜睪丸炎為主要特征。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將布魯氏菌病列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。布魯氏菌病的流行嚴重影響我市畜牧業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。

天津市屬于布魯氏菌病防控一類地區(qū)，我市采取肉羊布魯氏菌病強制免疫和監(jiān)測凈化的防治策略，對種羊采取非免疫監(jiān)測凈化的策略。本試驗采用三種不同血清學檢測方法——布魯氏菌病抗體cELISA檢測技術(shù)、免疫膠體金快速檢測技術(shù)及虎紅平板凝集檢測技術(shù)，在羊群經(jīng)口免疫S2疫苗后進行抗體監(jiān)測，旨在了解羊群免疫布魯氏菌S2疫苗后的抗體陽性率消減規(guī)律及不同血清學檢測方法敏感性的比較，為制定科學合理的免疫凈化程序和抗體檢測方法的選取提供理論依據(jù)，為我市肉羊布魯氏菌病免疫和防控工作提供參考。

一、材料與方法

1.實驗材料試驗設(shè)計

1）試驗動物。隨機選取某集約化肉羊養(yǎng)殖場60日齡健康綿羊30只。肉羊的飼養(yǎng)場所、飼料、飼養(yǎng)人員等養(yǎng)殖情況均相同。

2）免疫疫苗。羊群免疫所用疫苗為同一批次布魯氏菌弱毒活疫苗（S2株），疫苗在有效期內(nèi)，購自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司。

3）診斷試劑。三種血清學檢測試劑分別是：虎紅平板凝集試驗抗原及陰陽性對照血清（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）、牛布魯氏菌病抗體膠體金檢測卡（購自深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司）、牛布魯氏菌病抗體ELISA試劑盒（由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供）。

4）儀器設(shè)備：移液器、離心管、離心機、酶標儀。

2.試驗方法。對備選健康羊群經(jīng)口免疫接種布魯氏菌?。⊿2）弱毒苗，標準劑量為6×1010CFU活菌。免疫后分別用布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗、牛布魯氏菌病抗體膠體金快速檢測技術(shù)和牛布魯氏菌抗體ELISA試驗方法。對免疫奶牛持續(xù)進行抗體監(jiān)測。分別在免疫前和免疫后7d、15d、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月采集全血檢測。

3.結(jié)果判定。布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗按照國標（GB/T 18646-2002）進行操作和結(jié)果判定。虎紅平板凝集試驗在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判定。受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽性(+)，無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性(-)。

布魯氏菌病抗體快速檢測試紙條表面有字母“T”和“C”作為測試線和控制線。在提供任何樣品前，測試線和控制線在結(jié)果窗中都不顯示。控制線被用作程序控制。如果測試正常的完成，控制線試劑會工作，而且控制線會始終顯示。如果在樣品中含有足夠的布魯氏桿菌抗體，一條紫色的測試線會在結(jié)果窗口中顯示。

cELISA的判定標準為：在陰陽性對照結(jié)果成立的情況下，抑制率（PI）≥30%判為陽性，抑制率（PI）＜30%判為陰性。

圖1 肉羊經(jīng)口免疫布魯氏菌病S2疫苗后抗體陽性率消減規(guī)律

二、結(jié)果

肉羊經(jīng)口免疫布魯氏菌病S2疫苗后抗體陽性率消減規(guī)律見圖1。肉羊經(jīng)口免疫布魯氏菌病S2疫苗后三種方法檢測陽性率統(tǒng)計見表1。

表1 肉羊經(jīng)口免疫布魯氏菌病S2疫苗后三種方法檢測陽性率（%）

三、分析與討論

1.免疫前使用血清學三種方法對30只健康羊進行檢測，檢測結(jié)果均為抗體陰性，符合試驗條件。5月4日對30只羊進行免疫。免疫后7d出現(xiàn)抗體陽性結(jié)果。根據(jù)羊群免疫后抗體消長規(guī)律曲線顯示，免疫后1周可以檢測到免疫抗體，15d開始抗體陽性率進入高峰期。也有研究表明，羊群免疫S2疫苗后，在15～30d抗體凝集達到高峰。本試驗顯示，免疫抗體高峰持續(xù)50d左右，隨后群體中動物抗體檢測陽性率逐漸下降，5～6個月以后基本無法檢測到免疫抗體。免疫后5個月采血，三種方法均未檢測出陽性。

2.布魯氏菌弱毒活疫苗（S2）免疫健康羊群后能夠有效激發(fā)免疫應答，檢測抗體陽性率上升。布病疫苗以黏膜免疫和細胞免疫為主，現(xiàn)有血清學檢測方法主要用于體液免疫抗體的檢測，因此在免疫高峰期的抗體陽性率僅為50%。免疫后，血清學檢測陽性率不能完全體現(xiàn)個體抗體覆蓋率。

3.布魯氏菌免疫后期雖然檢測抗體陽性率逐漸下降，但是羊群仍然能夠保持一定的黏膜免疫和細胞免疫的保護力。臨床上在肉羊免疫凈化工作中推薦為每年定期免疫布魯氏菌病疫苗1次，每次免疫前進行血清學篩查，發(fā)現(xiàn)檢測陽性肉羊進行撲殺并進行無害化處理。逐年免疫清群，能夠減低個體流行率，逐年清群后可達到布魯氏菌病凈化的目的。

4.三種檢測方法進行比較，其中虎紅平板試驗和膠體金兩種方法具有操作簡單、快捷、便宜等特點，虎紅平板凝集試驗的結(jié)果根據(jù)肉眼判定，存在主觀偏移，可能造成結(jié)果偏差。而cELISA的試劑和設(shè)備成本較高，優(yōu)點是檢測敏感性和特異性較高且可以批量檢測?；⒓t平板凝集試驗推薦用于臨床初步篩查，可以使用cELISA進行確診。