1.安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校； 2.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230601

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、破壞性的自身免疫性關(guān)節(jié)疾病[1]，它的病因和發(fā)病機(jī)制未明確，以成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)異常增殖為主要的病理特征，進(jìn)而侵蝕和破壞軟骨組織，引起關(guān)節(jié)僵硬畸形及功能障礙，甚至殘疾。大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis，AA)模型是為RA研究提供的一種免疫性炎癥動(dòng)物模型，是目前篩選和研究治療 RA藥物的較理想模型[2]。這類動(dòng)物模型具有簡(jiǎn)單、實(shí)用、可靠等特點(diǎn)。白藜蘆醇( resveratrol，RES )是一種天然非黃酮類多酚化合物，分子式C14H12O3,存在于葡萄、決明等植物中。 RES具有抗增殖及調(diào)節(jié)免疫的作用，為抗風(fēng)濕治療提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1AA模型大鼠建模與滑膜細(xì)胞的培養(yǎng) SD雄性大鼠30只，180～200 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)和AA模型組(20只)，模型組大鼠左后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL弗氏完全佐劑致炎。24 d后，取AA模型建模成功的大鼠踝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)囊的滑膜層組織，將脂肪和纖維剔除，按照先前實(shí)驗(yàn)方法采用組織塊移植培養(yǎng)法培養(yǎng)滑膜細(xì)胞，傳代3～5代后選擇生長狀態(tài)良好，致密單層的細(xì)胞,消化后凍存于含血清的10%DMSO的培養(yǎng)液中,再置于-80℃保存或轉(zhuǎn)至液氮瓶中貯存[3]。

1.1.2滑膜細(xì)胞的鑒定 采用兔抗大鼠血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)多克隆抗體熒光鑒定，熒光倒置顯微鏡下可見滑膜細(xì)胞的生長狀況良好，滑膜細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，呈卵圓形。

1.2 方法

收集對(duì)數(shù)生長期的正常組和AA模型組滑膜細(xì)胞，以1.0×107/L的密度接種于6孔板中，每孔100 μL，在AA模型組加入不同濃度的RES 100 μL，RES的最終藥物濃度分別為0、1、5、20、50 μmol/L，在正常組和AA模型組每孔再加入100 μL 20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。制作電鏡標(biāo)本:取出6孔培養(yǎng)板，輕輕拍打，將貼壁生長的FLS細(xì)胞落入培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板中的細(xì)胞移入錐形離心管中，以800 r/min的速度離心8～10 min，再用吸管沿管壁輕輕地吸除上清液；將離心管中的細(xì)胞團(tuán)移入小瓶中，用PBS漂洗2次，每次15 min，再用濃度為3%戊二醛溶液固定，4℃下過夜，吸出固定劑，再用PBS漂洗3次，每次10 min，用1%四氧化鋨在4℃下固定30 min，接著用PBS漂洗3次；運(yùn)用系列丙酮在溫室下脫水，丙酮溶液濃度逐漸升高，濃度依次為：50%、70%、90%、100%，脫水的次數(shù)與時(shí)間依次為：1次10 min； 1次10 min； 2次，每次10 min；最后3次，每次10 min；吸出瓶中的脫水劑，等體積比加入稀釋的包埋劑，30 min后，棄除稀釋的包埋劑，加入純包埋劑，室溫放置2 h；把細(xì)胞團(tuán)塊移入底部滴加混合包埋劑的膠囊模塊中，注滿包埋劑，放烤箱60℃烘烤2 h，使其固化并用超薄切片機(jī)切取70 nm厚度的超級(jí)切片； 將其放于干凈培養(yǎng)皿中的牙科石蠟片上滴加檸檬酸鉛染色液，讓有切片的一面朝下并使載網(wǎng)浮在液滴上，蓋上培養(yǎng)皿染色5～30 min，立即用雙蒸水清洗3次。吸去多余水分，置培養(yǎng)皿內(nèi)自然干燥。再以同樣方法將載網(wǎng)放在另一只備有蠟片的培養(yǎng)皿中進(jìn)行檸檬酸鉛的染色及清洗。晾干后待觀察；用日本JEOL-1230透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié) 果

正常的大鼠細(xì)胞有MLS和FLS兩型滑膜細(xì)胞，其中以MLS為主，透射電鏡下觀察MLS主要特征：高爾基復(fù)合體很發(fā)達(dá)，核染色質(zhì)相對(duì)致密，大部分看不到核仁，細(xì)胞表面許多細(xì)長突起向細(xì)胞間質(zhì)突出，細(xì)胞之內(nèi)散在分布多種囊泡和小泡。FLS主要特征：細(xì)胞質(zhì)中缺乏高爾基復(fù)合體、囊泡及小泡，而粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體豐富，細(xì)胞核染色質(zhì)比較疏松呈現(xiàn)細(xì)顆粒分布在細(xì)胞核的周圍。AA大鼠模型組多見FLS，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體腫脹、嵴被破壞，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象，MLS數(shù)量減少。給予RES的AA大鼠給藥組也以FLS為主，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的數(shù)量減少，但是略有擴(kuò)張，線粒體腫脹減輕，以高濃度RES(50 μmol/L)改善最明顯，部分滑膜細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊聚、核固縮，形成凋亡小體，斷裂的染色質(zhì)形成粗細(xì)不等顆粒分散在細(xì)胞質(zhì)中。見圖1。

A.正常MLS(×12000)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見較多的小泡和囊泡；B.正常FLS(×12000)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的游離核糖體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；C.AA模型大鼠滑膜細(xì)胞(×12000)，線粒體腫脹、嵴突破壞；D.白藜蘆醇(50 μmol/L)處理組(×12000)，可見線粒體腫脹減退，囊泡恢復(fù)明顯。
圖1 大鼠滑膜組織電鏡檢查

3 討 論

滑膜細(xì)胞是關(guān)節(jié)滑膜層的最大細(xì)胞群體，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞根據(jù)形態(tài)學(xué)的差異可分為巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(macrophage-like synoviocyte，MLS)和成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)，即為通常所說的A型和B型滑膜細(xì)胞[4]。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(arthritis， RA)中關(guān)節(jié)損傷的最終效應(yīng)細(xì)胞即A、B型細(xì)胞，A型細(xì)胞內(nèi)的線粒體為細(xì)胞的代謝提供能量，高爾基復(fù)合體參與分泌活動(dòng)；B型細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有分泌蛋白質(zhì)的功能[5]。RA中炎癥發(fā)生致使滑膜細(xì)胞增殖和血管新生，將體外培養(yǎng)成功的AA大鼠模型踝關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞采用透射電鏡觀察細(xì)胞功能變化，比較正常的滑膜細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)模型組滑膜細(xì)胞中具有分泌能力的高爾基復(fù)合體數(shù)量有所增加，加入不同濃度的RES治療組發(fā)現(xiàn)滑膜細(xì)胞中的高爾基復(fù)合體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和囊泡的數(shù)量卻有所減少，表明RES能降低亢進(jìn)的滑膜細(xì)胞功能，降低滑膜細(xì)胞的變性，繼而保護(hù)滑膜細(xì)胞細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)。細(xì)胞凋亡時(shí)以線粒體的改變較為敏感，在細(xì)胞凋亡的早期，線粒體腫大、嵴增多、隨之線粒體空泡化。加入RES濃度為20、50 μmol/L時(shí)，培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞部分線粒體出現(xiàn)腫脹、嵴增多、空泡化，提示RES可以促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡，RES通過降低AA大鼠滑膜細(xì)胞具有分泌功能細(xì)胞器的數(shù)量和功能從而減輕繼發(fā)性炎癥，使其可能具有治療AA的作用。RES為50 μmol/L時(shí)，可見滑膜細(xì)胞中的染色質(zhì)濃縮、邊聚、核固縮，核碎片形成，提示高濃度的RES對(duì)于AA大鼠卻具有促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡的作用。