王 丹 王少鵬 馮軍超 徐興魯 邢立超

山東新創(chuàng)生物科技有限公司 山東 濟南 250101

流式細胞術(Flow Cytometry,FCM)從20 世紀60 年代后期創(chuàng)建以來,發(fā)展迅速,最初主要用于科學研究和臨床試驗[1],在微生物領域應用較少,并且起步相對較晚,但是近年來,在國外流式細胞術已經(jīng)廣泛應用于微生物的相關檢測,而國內(nèi)在這方面的應用則較少。

并且,隨著電子、激光、計算機等方面的快速發(fā)展與進步,流式細胞儀也在不斷完善與更新,如今流式細胞儀已經(jīng)在微生物檢測中扮演著越來越重要的角色。微生物中,特別是細菌,在生產(chǎn)或研究中往往需要對其進行快速測定,并且也需要也對細菌數(shù)量、大小、活性等進行多參數(shù)分析,而流式細胞儀自身的特性恰好符合這樣的檢測需求[2]。目前,已經(jīng)有較多相關檢測方法的報道,本文中主要從細菌計數(shù)、無菌檢查、生產(chǎn)在線監(jiān)測等幾個方面,介紹流式細胞儀在工業(yè)生產(chǎn)中細菌檢測相關應用。

1 流式細胞儀的結構及工作原理

流式細胞儀的結構一般可以分為5個部分,包括流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)、激光光源及光束形成系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、信號檢測顯示儲存分析系統(tǒng)、細胞分選系統(tǒng)。

將待測樣本制備成單細胞懸液,經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中,在氣體的壓力下,進入充滿流動的鞘液。當鞘液壓力和樣品壓力達到一定程度的壓差,在鞘液的約束下細胞排列成單列,由流動室的噴嘴流出,形成細胞注經(jīng)過激光聚焦區(qū),與入射的激光束垂直想交,經(jīng)特異的熒光染料染色的細胞被激光激發(fā)產(chǎn)生特定波長的熒光。儀器中一系列光學系統(tǒng),收集熒光等光學信號,由計算機系統(tǒng)進行收集、存儲、顯示并分析被檢測到的各種信號,對各種指標做出統(tǒng)計分析[3]。

2 FCM 在細菌計數(shù)中的應用

傳統(tǒng)的細菌計數(shù)方法為微生物平板計數(shù)法或者顯微鏡計數(shù)板計數(shù),雖然這種計數(shù)方法適用范圍廣,但是也存在較多難以克服的缺點,如時間長、操作步驟復雜、工作量大等,并且微生物平板計數(shù)法僅能對活菌計數(shù),對于失去活性的細菌則無法計數(shù)。

而流式細胞術,可以克服傳統(tǒng)計數(shù)方法耗時長、操作步驟繁瑣等問題,并且可以區(qū)分出細菌的死活,并進行定量分析。王銀環(huán)等[4]使用BD FASS Microcount檢測了3種地衣芽孢活菌制劑中的活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率,測定過程簡單、便捷、快速,并且與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法相比無顯著性差異,檢測結果穩(wěn)定可靠；汪沐等[5]建立了熒光原位雜交和流式細胞術結合(FISH-FCM)快速測定肉食品中腸桿菌的方法,與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方法相比,極大的縮短了檢測時間,并且該方法的檢出率為100%,適用性較強；姜凱[6]構建了流式細胞術檢測乳酸菌數(shù)量的方法,通過使用PI(碘化丙錠)和SYTO?24兩種熒光染料對死菌和活菌染色,對10多個批次的發(fā)酵劑、發(fā)酵乳飲料、發(fā)酵乳等產(chǎn)品進行了檢測,與現(xiàn)行國標方法進行對比,并無顯著性差異,且重現(xiàn)性好、單個樣品檢測時間不超過5min,極大的縮短了檢測周期,克服了檢測嚴重滯后于生產(chǎn)過程的難題。

此外,劉春春等[7]在對枯草芽孢桿菌的多態(tài)異質(zhì)性分析中,使用BD Influx(spo),對50nm～500nm 標準尺寸微球進行靈敏度分析,結果顯示在對300nm 以上的微粒均具有較高的靈敏度,這解決了細菌休眠體芽孢等小微粒難以精確分析的難題,促進了流式細胞術進一步發(fā)展。

3 FCM 在無菌檢測中的應用

在藥品生產(chǎn)中,微生物無菌檢查是控制保證藥品質(zhì)量的關鍵因素,是生產(chǎn)中必不可少的監(jiān)測指標。各國藥典中的無菌檢查方法均是通過觀察培養(yǎng)基培養(yǎng)后的混濁情況來判斷產(chǎn)品的無菌情況,此方法同樣具有檢測周期長、操作過程復雜等缺點。

近些年來,國內(nèi)外已經(jīng)有出現(xiàn)較多新興方法進行無菌檢查,由于檢測時間快、靈敏度高,流式細胞術也較多的用于無菌檢查。宋光艷等[8]使用SYTO9熒光染料對藥品中的微生物進行熒光標記后,采用流式細胞術對兩種類型(溶液和無菌粉末)注射劑檢測,檢出限均＜10CFU,與藥典法相比,檢出時間比常規(guī)方法縮短40%～70%,可作為法定檢查方法的有效補充；Mohr H 等[9]使用噻唑橙熒光染料對10余種細菌進行熒光標記后,使用流式細胞術對PCs(血小板濃縮物)進行檢測,研究顯示,在接種大約1CFU/m L的細菌,37℃孵育的條件下,多數(shù)種類細菌在21小時內(nèi)或更短的時間內(nèi)可以被檢測到；盧昕等[10]采用流式細胞術對接處鏡護理液進行無菌檢查,結果顯示當污染量在1～109CFU 范圍時,可直接得出含菌量,同時可有效縮短檢出時間。

此外,也有許多其它檢測方法用于無菌檢查,如采用生物熱動力學方法、Q-PCR 方法等[10],與傳統(tǒng)方法相比,均具有縮短檢測周期、操作流程簡單等特點,這極大的提高了生產(chǎn)效率,加快了產(chǎn)品投入市場。

4 FCM 在生產(chǎn)在線監(jiān)測中的應用

由于生產(chǎn)中終產(chǎn)品的的合格依靠于生產(chǎn)中各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制,因此在生產(chǎn)中實施在線監(jiān)測具有重要意義。

目前,國外已有研究人員采用流式細胞術對生產(chǎn)中在線監(jiān)測技術進行了探索。2000年設計了一種強大的流式細胞檢測系統(tǒng)(FI-FCM),通過此檢測系統(tǒng)的在線監(jiān)測系統(tǒng),得到了大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)過程的完整生長曲線[8]；亦應用FI-FCM 流式細胞檢測系統(tǒng),通過頻繁采樣(每5min一次),實現(xiàn)在線、實時監(jiān)測生物反應器中微生物細菌的生長變化情況；應用具有毫秒分辨率的RT-FCM(Real time Flow Cytometry)流式細胞檢測系統(tǒng),實時監(jiān)測生物反應器中多樣微生物的高動態(tài)發(fā)展過程,文中通過進行4個不同微生物相關研究方向的實驗,證明此檢測系統(tǒng)在對各種生物實驗的廣泛適用性和可以對具有復雜的生物過程如發(fā)酵等收集到更加詳細、時間上更加連續(xù)的信息,這也有助于工業(yè)生產(chǎn)中優(yōu)良菌株的篩選[3]。

而國內(nèi)還較少應用流式細胞術對生產(chǎn)過程進行在線監(jiān)測,更多是應用在海洋生態(tài)系統(tǒng)中生物的實時監(jiān)測[11],如果將FCM 更多的應用在工業(yè)生產(chǎn)中,尤其是微生物發(fā)酵等過程,能夠更好地收集到菌體發(fā)酵多參數(shù)的信息,這對整個生產(chǎn)工藝過程的質(zhì)量控制具有重大意義。

總結

除了在工業(yè)生產(chǎn)中,流式細胞術也廣泛應用于在科學研究、臨床檢測、生態(tài)環(huán)境等各個領域,尤其對一些微小粒子來說,其具有的逐個分析、靈敏、快速、多參數(shù)分析等優(yōu)勢,更是受到了大家的青睞；雖然流式設備一般價格昂貴,前期成本較高,但是相信隨著科技的飛速發(fā)展,難題也將逐漸解決,流式細胞術也將有更加廣闊的應用前景。